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成人T細胞性白血病リンパ腫細胞の増殖に必須のBATF3-IRF4転写因子複合体

中川 雅夫
(米国NIH National Cancer Institute,Lymphoid Malignancies Branch)
email:中川雅夫
DOI: 10.7875/first.author.2018.072

Targeting the HTLV-I-regulated BATF3/IRF4 transcriptional network in adult T cell leukemia/lymphoma.
Masao Nakagawa, Arthur L. Shaffer, Michele Ceribelli, Meili Zhang, George Wright, Da Wei Huang, Wenming Xiao, John Powell, Michael N. Petrus, Yibin Yang, James D. Phelan, Holger Kohlhammer, Sigrid P. Dubois, Hee Min Yoo, Emmanuel Bachy, Daniel E. Webster, Yandan Yang, Weihong Xu, Xin Yu, Hong Zhao, Bonita R. Bryant, Joji Shimono, Takashi Ishio, Michiyuki Maeda, Patrick L. Green, Thomas A. Waldmann, Louis M. Staudt
Cancer Cell, 34, 286-297.e10 (2018)




要 約


 成人T細胞性白血病リンパ腫はヒトT細胞白血病ウイルスI型のキャリアのごく一部において長い潜伏期間ののち発症する,きわめて予後の不良なT細胞性リンパ腫であり,治療の新規の標的を見い出すため分子機構の解明がもとめられている.この研究において,筆者らは,成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株およびshRNAライブラリーを用いた機能スクリーニングにより,BATF3およびIRF4からなる転写因子複合体が細胞の増殖に必須であることを見い出した.BATF3遺伝子座にはスーパーエンハンサーとよばれる広範なエンハンサーが存在し,そこにヒトT細胞白血病ウイルスI型のゲノムにコードされるHBZが転写因子として結合し,さらに,BATF3-IRF4転写因子複合体も結合することにより,成人T細胞性白血病リンパ腫細胞においてBATF3遺伝子が高く発現することが明らかにされた.また,成人T細胞性白血病リンパ腫細胞のBATF3遺伝子座のスーパーエンハンサーの機能はBET阻害剤により抑制され,BATF3遺伝子の発現は低下し細胞の増殖は停止した.

はじめに


 成人T細胞性白血病リンパ腫(adult T-cell leukemia/lymphoma:ATLL)は,ヒトT細胞白血病ウイルスI型(HTLV-I:human T-cell leukemia virus type I)がCD4陽性T細胞へ感染しキャリアとして約50年という長い期間をへたのち,そのごく一部に発症するT細胞性リンパ腫である.T細胞性リンパ腫はB細胞性リンパ腫と比べ予後が悪いが,なかでも成人T細胞性白血病リンパ腫の予後はきわめて不良であり,新規の治療法を開発する基盤となる分子生物学的な解析がもとめられている.HTLV-IのゲノムのpX領域にコードされるTaxは強力ながん遺伝子産物であり,腫瘍の形成の早期から重要な役割を担うことが指摘されてきた.しかし,その宿主免疫への高い抗原性から,成人T細胞性白血病リンパ腫の形成にいたるまで50%以上の症例においてHTLV-Iのゲノムの部分欠失あるいはDNAメチル化が起こりTax遺伝子の発現は消失する.一方,HTLV-Iのゲノムのマイナス鎖にコードされるHBZは成人T細胞性白血病リンパ腫のすべての症例において発現しており,成人T細胞性白血病リンパ腫の形成および維持にかかわる役割について解析が進んできた.
 成人T細胞性白血病リンパ腫の発症にいたるまできわめて長い潜伏期間を要することは,ウイルスの側の因子にくわえ,体細胞の遺伝子に蓄積するゲノムあるいはエピゲノムの異常が腫瘍の形成および維持にきわめて重要であることを意味する.これまでに,筆者らは,次世代シークエンス解析により,成人T細胞性白血病リンパ腫に特徴的なCCR4遺伝子において機能亢進型の変異がきわめて高頻度で認められることを報告した1).のちに,ほかの研究グループから,成人T細胞性白血病リンパ腫に対するさらに大規模な次世代シークエンス解析の結果が報告されたが2)新着論文レビュー でも掲載),そこでもほぼ同じ頻度でCCR4遺伝子に変異が認められ,成人T細胞性白血病リンパ腫におけるCCR4遺伝子の変異の重要性が再確認された.成人T細胞性白血病リンパ腫において高頻度に変異が認められるほかの遺伝子やシグナル伝達経路についても明らかにされ,発症機構の理解にきわめて重要な情報が提供された.
 しかし,これら変異をもつ遺伝子が治療の標的になりうるかは,また別の問題として考えなければならない.HTLV-IのTax遺伝子がそうであるように,ある遺伝子の変異は成人T細胞性白血病リンパ腫の形成には重要である一方,すでに形成された成人T細胞性白血病リンパ腫の維持には不要である可能性がある.さらに,遺伝子に変異はもたないが,発現量の変化などにより腫瘍の維持にきわめて重要なはたらきをするタンパク質も存在する.すなわち,治療の標的という観点からは,腫瘍の増殖や生存にかかわる機能的なタンパク質を遺伝子の変異の有無にかかわらず網羅的に解析する必要がある.この研究において,筆者らは,免疫細胞に関連する1051個の遺伝子を変異の有無にかかわらず対象としてshRNAライブラリーを用いた機能スクリーニングを施行し,成人T細胞性白血病リンパ腫細胞の増殖あるいは生存に必須の遺伝子を網羅的に探索した.

1.転写因子であるIRF4およびBATF3は成人T細胞性白血病リンパ腫細胞の増殖に必須である


 shRNAライブラリーを用いた機能スクリーニングとして,shRNAを発現するレトロウイルスのライブラリーを標的となる細胞に対しひとつの細胞にひとつのshRNAとなるよう感染させたのち,ドキシサイクリンの投与によりshRNAを発現させた.細胞を継代培養し,shRNAを発現させてから21日後に回収して,どのshRNAに感染した細胞の数が減少したか解析した.この方法はこれまで,B細胞性リンパ腫の治療の標的となる遺伝子の同定に画期的な成果をあげてきた3-5).8種類の成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株に対しスクリーニングを施行したところ,7種類あるいは8種類の成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株において細胞の数を50%以上減少させるshRNAとしてIRF4遺伝子およびBATF3遺伝子に対するshRNAが同定された.IRF4は免疫細胞に特異的に発現する転写因子であり,これまで,成人T細胞性白血病リンパ腫における高発現6),治療の感受性との関連7),変異遺伝子の存在2) が報告されており,成人T細胞性白血病リンパ腫における重要性が示唆されていた.BATF3bZIP型の転写因子であるが,これまで,成人T細胞性白血病リンパ腫の分子病態に関する報告はまったくなく,また,遺伝子の変異の報告もなかった.
 これまでのノックアウトマウスを用いた解析において,BATF3のファミリータンパク質であり構造的および機能的に高度に類似するBATFはIRF4と複合体を形成し,ゲノムにおいてAICEモチーフとよばれるコンセンサス配列と結合することにより正常なヘルパーT細胞の分化および機能にかかわることが報告されていた8).正常なT細胞におけるBATF3の機能の解析は十分にはなされていないが,これは,正常なT細胞においてはBATFの発現が高く優勢的に機能しており,BATF3は補助的な役割をもつにすぎないからではないかと推察された.ウェスタンブロット法により,成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株においてはBATFではなくBATF3の発現が上昇していることが明らかにされた.以上より,転写因子であるBATF3およびIRF4は成人T細胞性白血病リンパ腫細胞の増殖に必須であることが明らかにされた.

2.BATF3-IRF4転写因子複合体は成人T細胞性白血病リンパ腫を特徴づける遺伝子の発現を促進する


 BATF3およびIRF4が成人T細胞性白血病リンパ腫細胞のゲノムにおいて実際に複合体として機能するかどうかを検討するため,ChIP-seq法によりゲノムにおける結合部位を網羅的に同定した.その結果,BATF3IRF4は結合部位の80%以上が共通しており,共通する結合部位にはAICEモチーフが有意に高頻度で認められた.このことから,BATF3およびIRF4が成人T細胞性白血病リンパ腫細胞のゲノムにおいて空間的に複合体を形成することが示唆された.
 shRNAによりBATF3あるいはIRF4をノックダウンした成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株において発現の低下した遺伝子をマイクロアレイを用いて同定し,ChIP-seq法により発現の低下した遺伝子の近傍にBATF3あるいはIRF4の結合が認められたとき“直接標的遺伝子”と定義した.BATF3の直接標的遺伝子とIRF4の直接標的遺伝子を比較したところ有意に重複しており,BATF3およびIRF4は空間的および機能的に複合体として機能することが示唆された.
 ここまでの解析は細胞株を用いていたため,これらの結果が成人T細胞性白血病リンパ腫の患者における遺伝子の発現と矛盾しないものであるかどうか検討した.患者の検体におけるマイクロアレイを用いたデータにおいて,成人T細胞性白血病リンパ腫におけるBATF3遺伝子およびIRF4遺伝子の発現は別のT細胞リンパ腫である末梢性T細胞性リンパ腫分類不能型と比較して有意に高かった.また,エンリッチメント解析において,成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株を用いた解析から得られたBATF3およびIRF4に共通する68個の直接標的遺伝子は,末梢性T細胞性リンパ腫分類不能型の患者と比較して,成人T細胞性白血病リンパ腫の患者において高く発現する遺伝子に有意に濃縮されていた.すなわち,BATF3およびIRF4は成人T細胞性白血病リンパ腫の患者を特徴づける遺伝子の発現を促進することが示唆された.この68個の直接標的遺伝子のひとつは重要ながん遺伝子であるMYC遺伝子であった.さらに,BATF3遺伝子も含まれており,自己フィードバックループが成人T細胞性白血病リンパ腫おけるBATF3の高い発現の機序のひとつである可能性が示唆された.

3.HTLV-IにコードされるHBZにより成人T細胞性白血病リンパ腫においてBATF3遺伝子の発現が促進される


 成人T細胞性白血病リンパ腫の維持においてはHTLV-IのゲノムにコードされるHBZがその役割の一端を担うと考えられたことから,成人T細胞性白血病リンパ腫におけるBATF3あるいはIRF4の高い発現がHBZによりもたらされる可能性について検討した.新しいゲノム編集技術であるCRISPR法を用いて成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株においてHBZ遺伝子をノックアウトしたところ,BATF3の発現は低下したが,IRF4の発現に大きな変化はみられなかった.HBZのはたらきをより詳細に検討するため,成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株のゲノムにおけるHBZの結合部位をChIP-seq法により網羅的に同定した.その結果,HBZBATF3遺伝子の内部および3'側の2箇所に結合した.HBZのノックアウトによりBATF3のタンパク質レベルでの発現のみならずmRNAレベルの発現も低下した.これらのデータから,HBZは転写因子としてBATF3遺伝子座に結合しその発現を促進することが明らかにされた.このことは,成人T細胞性白血病リンパ腫細胞においてはBATFよりもBATF3の発現および機能が支配的であるという事実に対する部分的な説明になりうると考えられた.
 HBZをノックアウトした成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株において発現の低下した遺伝子をマイクロアレイを用いて同定し,ChIP-seq法の結果を組み合わせてHBZの直接標的遺伝子として79個の遺伝子を同定した.このなかからCRISPR法を用いて74個の遺伝子をノックアウトし,それぞれの細胞の数の減少について検討したところ,細胞の数が50%以上減少した遺伝子は4個のみであり,細胞の数がもっとも減少したのはBATF3遺伝子をノックアウトした細胞であった.このことから,HBZの直接標的遺伝子のうちBATF3遺伝子がきわめて重要であることが示唆された.

4.成人T細胞性白血病リンパ腫細胞のBATF3遺伝子座にはスーパーエンハンサーが存在する


 成人T細胞性白血病リンパ腫におけるBATF3およびIRF4の高い発現をさらに説明する分子的な異常はないだろうか? 近年,がん遺伝子の高い発現にはエンハンサーがきわめて広範囲に形成される現象の関与することが報告され,スーパーエンハンサーとよばれている9).ChIP-seq法により成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株においてスーパーエンハンサーを同定したところ,BATF3遺伝子座にスーパーエンハンサーが見い出された.IRF4遺伝子座については,一部の細胞株においてスーパーエンハンサーが見い出されたがほかの細胞株においてはみられず一貫しなかった.BATF3遺伝子座のスーパーエンハンサーにはHBZの結合部位およびBATF3-IRF4転写因子複合体の結合部位が含まれており,これらの転写因子によるBATF3遺伝子の発現の促進にスーパーエンハンサーの存在が深く関与することが推察された.

5.BET阻害剤により成人T細胞性白血病リンパ腫細胞の増殖は停止する


 スーパーエンハンサーにおいてはヒストンH3Lys27がアセチル化しており,ここにBRD4を代表とするブロモドメインタンパク質が結合することにより遺伝子の発現が強く促進されることが知られている.BET阻害剤はブロモドメインタンパク質とアセチル化したLysとの結合を阻害することによりスーパーエンハンサーの機能を比較的選択的に阻害することが報告されている9).そこで,成人T細胞性白血病リンパ腫細胞のBATF3遺伝子座のスーパーエンハンサーの機能もBET阻害剤により阻害されるのではないかと考えた.代表的なBET阻害薬であるJQ1を用いたところ,検討した成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株のすべてにおいて,BATF3の発現がmRNAレベルおよびタンパク質レベルにて低下した.BATF3の発現に対するBET阻害剤の顕著な効果は成人T細胞性白血病リンパ腫の患者の末梢血から採取された腫瘍細胞においてもみられ,BATF3の発現を低下させ細胞の増殖を停止させた.BET阻害剤の有効性については,生体における生物学的な利用能(bioavailability)にすぐれたCPI-203を用いて,成人T細胞性白血病リンパ腫の細胞株を用いた異種移植モデルにおいても証明された.

おわりに


 この研究において,筆者らは,成人T細胞性白血病リンパ腫の維持においてBATF3-IRF4転写因子複合体はきわめて重要な機能を担っており,治療の標的となりうることを見い出した.HTLV-IのゲノムにコードされるHBZは転写因子としてBATF3遺伝子の発現を促進し,BATF3IRF4とゲノムのAICEモチーフにおいて結合し,BATF3の発現を自己フィードバックループにより促進しつつ,成人T細胞性白血病リンパ腫を特徴づける遺伝子の発現を制御し,細胞の増殖に必須の役割を担う.HBZBATF3IRF4によるBATF3遺伝子の発現の促進にはBATF3遺伝子座のスーパーエンハンサーが深く関与する.これに対しBET阻害薬を用いることにより,BATF3の発現を低下させる治療的な介入が有効である可能性が示された(図1).現在,BET阻害剤は世界的に開発が進められており,より副作用の少ない製剤が開発された際には成人T細胞性白血病リンパ腫における有効性を検討する価値があるだろう.



 この研究により示されたもうひとつの重要な点は,機能スクリーニングにより遺伝子に変異のみられないBATF3が成人T細胞性白血病リンパ腫の治療の標的となるタンパク質として見い出されたという事実である.B細胞性リンパ腫においても同様の現象があり,BTKに遺伝子の変異は見い出されないがB細胞性リンパ腫細胞の増殖および生存に深くかかわり,その阻害薬であるibrutinibは,現在,多くの国で使用されている.次世代シークエンス法による遺伝子の変異の解析により見い出せない機能的に重要な遺伝子をみつけていくため,網羅的な機能スクリーニングはT細胞リンパ腫における分子生物学的な研究において欠くことのできない有用なツールのひとつであると考えている.

文 献



  1. Nakagawa, M., Schmitz, R., Xiao, W. et al.: Gain-of-function CCR4 mutations in adult T cell leukemia/lymphoma. J. Exp. Med., 211, 2497-2505 (2014)[PubMed]

  2. Kataoka, K., Nagata, Y., Kitanaka, A. et al.: Integrated molecular analysis of adult T cell leukemia/lymphoma. Nat. Genet., 47, 1304-1315 (2015)[PubMed] [新着論文レビュー]

  3. Ngo, V. N., Davis, R. E., Lamy, L. et al.: A loss-of-function RNA interference screen for molecular targets in cancer. Nature, 441, 106-110 (2006)[PubMed]

  4. Ngo, V. N., Young, R. M., Schmitz, R. et al.: Oncogenically active MYD88 mutations in human lymphoma. Nature, 470,115-119. (2011)[PubMed]

  5. Schmitz, R., Young, R. M., Ceribelli, M. et al.: Burkitt lymphoma pathogenesis and therapeutic targets from structural and functional genomics. Nature, 490, 116-120 (2012)[PubMed]

  6. Imaizumi, Y., Kohno, T., Yamada, Y. et al.: Possible involvement of interferon regulatory factor 4 (IRF4) in a clinical subtype of adult T-cell leukemia. Jpn. J. Cancer Res., 92, 1284-1292 (2001)[PubMed]

  7. Ramos, J. C., Ruiz, P. Jr., Ratner, L. et al.: IRF-4 and c-Rel expression in antiviral-resistant adult T-cell leukemia/lymphoma. Blood, 109, 3060-3068 (2007)[PubMed]

  8. Murphy, T. L., Tussiwand, R. & Murphy, K. M.: Specificity through cooperation: BATF-IRF interactions control immune-regulatory networks. Nat. Rev. Immunol., 13, 499-509 (2013)[PubMed]

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著者プロフィール


中川 雅夫(Masao Nakagawa)
略歴:2006年 北海道大学大学院医学研究院博士課程 修了,愛知県がんセンター研究所 主任研究員,2011年 米国NIH National Cancer Instituteポストドクトラルフェローを経て,2016年より北海道大学大学院医学研究院 助教.
研究テーマ:悪性リンパ腫の分子生物学的な解析.
抱負:これまでわからなかったことをよく調べて,自分なりに理解して伝えられるよう努めたい.

© 2018 中川 雅夫 Licensed under CC 表示 2.1 日本