さまざまな悪性腫瘍における3’側非翻訳領域の構造異常によるPD-L1遺伝子の異常な発現
片岡圭亮・小川誠司
（京都大学大学院医学研究科 腫瘍生物学講座）
email：片岡圭亮
DOI: 10.7875/first.author.2016.050
Aberrant PD-L1 expression through 3'-UTR disruption in multiple cancers.
Keisuke Kataoka, Yuichi Shiraishi, Yohei Takeda, Seiji Sakata, Misako Matsumoto, Seiji Nagano, Takuya Maeda, Yasunobu Nagata, Akira Kitanaka, Seiya Mizuno, Hiroko Tanaka, Kenichi Chiba, Satoshi Ito, Yosaku Watatani, Nobuyuki Kakiuchi, Hiromichi Suzuki, Tetsuichi Yoshizato, Kenichi Yoshida, Masashi Sanada, Hidehiro Itonaga, Yoshitaka Imaizumi, Yasushi Totoki, Wataru Munakata, Hiromi Nakamura, Natsuko Hama, Kotaro Shide, Yoko Kubuki, Tomonori Hidaka, Takuro Kameda, Kyoko Masuda, Nagahiro Minato, Koichi Kashiwase, Koji Izutsu, Akifumi Takaori-Kondo, Yasushi Miyazaki, Satoru Takahashi, Tatsuhiro Shibata, Hiroshi Kawamoto, Yoshiki Akatsuka, Kazuya Shimoda, Kengo Takeuchi, Tsukasa Seya, Satoru Miyano, Seishi Ogawa
Nature, 534, 402-406 (2016)
進行がんを含むさまざまな悪性腫瘍における抗PD-1/PD-L1抗体による予後の改善は，発がんの過程における免疫回避の機構の重要性を示す．しかし，この免疫チェックポイントを介した免疫回避の機構の遺伝学的な基盤はほとんど明らかにされていない．筆者らは，この研究において，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に集積する構造異常による新たな免疫回避の機構について明らかにした．この構造異常は，成人T細胞白血病，びまん性大細胞型リンパ腫，胃がんを含むさまざまな悪性腫瘍において認められ，例外なく，3’側非翻訳領域の切断による転写産物の安定化を介したPD-L1遺伝子の異常な発現をともなっていた．さらに，さまざまな細胞株のゲノムにこの構造異常を導入すると，PD-L1遺伝子の発現の顕著な上昇およびin vivoにおける腫瘍の増殖や免疫回避の促進が認められたが，この効果は抗PD-L1抗体により阻害された．これらの結果から，免疫回避を介したクローン選択におけるPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の重要性のみならず，抗PD-1/PD-L1抗体の効果を予測する遺伝子マーカーとしてのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における構造異常の有用性が示唆された．
進行がんを含むさまざまな悪性腫瘍における，抗PD-1/PD-L1抗体などの免疫チェックポイント阻害剤による患者の予後の改善は，発がんの過程における免疫回避の機構の重要性を示す1,2)．しかし，この免疫チェックポイントを介した免疫回避の機構の遺伝学的な基盤は，Hodgkinリンパ腫，一部のB細胞リンパ腫，胃がんなどにおいて認められるPD-L1遺伝子の高度の増幅およびプロモーター領域の置換をともなう染色体の転座のほか，ほとんど明らかではない3,4)．
転座，逆位，重複，欠失などの染色体の構造異常はがんのゲノムにおいて広く認められる5,6)．なかでも，最近，注目をあつめているのは，GFI1遺伝子やTERT遺伝子などのがんドライバー遺伝子の活性化の機構として報告されている非コード領域における構造異常である7)．しかし，その解析の困難さから，悪性腫瘍におけるゲノムの構造異常の全体像の解明はまだ途上である．
なお，がん免疫療法については，杉山大介・西川博嘉, 領域融合レビュー, 4, e005 (2015) も参照されたい．
そのようなゲノムの構造異常を同定するため新たな解析プラットフォームを開発し，49例の成人T細胞白血病の全ゲノムデータを再解析した8)（新着論文レビュー でも掲載）．その結果，13例においてPD-L1遺伝子座の3’側に切断点の集積する新規の構造異常が同定された．この構造異常は染色体の欠失，逆位，転座，重複などさまざまであったが，そのタイプにかかわらず，すべての例において異常なPD-L1遺伝子のアレルが形成されていた．12例においてはPD-L1遺伝子の3’側のエキソンが非コード領域の塩基配列と置換されており，1例においては最終エキソンにおいて327 bpの逆位が起こっていた．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつすべての症例において，PD-L1遺伝子の発現の顕著な上昇が認められた．原因となる構造異常から予測されたとおり，過剰に発現したPD-L1遺伝子をコードする転写産物のすべてに構造変化の起こっていることが，RNAシークエンス解析により確認された．10例においてはポリAシグナル配列を含むイントロンあるいは遺伝子間領域に由来する塩基配列がPD-L1遺伝子の5’側に融合しており，2例においてはもともとPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に存在する通常は使用されていないポリAシグナル配列による早期の転写終結が認められた．残りの1例においては3’側非翻訳領域において327 bpの逆位を起こした塩基配列に新たなポリAシグナル配列が形成され，予期せぬ転写終結がひき起こされていた．すなわち，これらのPD-L1遺伝子の異常な転写産物において，いずれも正常な3’側非翻訳領域が欠損していた．この結果，および，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつほとんどの症例においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における発現が欠損していたことから，正常な転写産物と比較して異常な転写産物が優位に存在することは明らかであり，このことは，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においてエキソン4と3’側非翻訳領域の発現比が顕著に高いことに反映されていた．
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例のうち，6例においてはPD-L1のORFが保たれていたが，残りの例においてはイントロン5あるいはイントロン6に切断点があり，PD-L1は途中で切断されていた．これらの異常なPD-L1にはすべての例において細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインが保たれており，細胞膜への発現およびPD-1との結合能は維持されていることが予想された．実際に，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例から得られた2種類の異常なPD-L1が，細胞膜への発現およびPD-1との結合能において正常なPD-L1と同様に機能することがフローサイトメトリー解析により確認された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ患者に由来する細胞においてもPD-L1が発現していること，および，構造異常をもたない患者に由来する細胞よりもはるかに高いPD-L1の発現を示すことが明らかにされた．逆に，PD-L1遺伝子の3’側の近傍に遺伝子がコードされるPD-1のもうひとつのリガンドであるPD-L2の発現はPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における構造異常の有無により差が認められず，PD-L1遺伝子の構造異常はPD-L2遺伝子の発現には影響しないことが確認された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞においてはPD-1の結合能が増強しており，これは，過剰に発現したPD-L1に起因すると考えられた．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ患者におけるPD-L1の過剰な発現は免疫染色法およびウェスタンブロット法によっても確認された．
PD-L1遺伝子の過剰な発現をともなう3’側非翻訳領域に集積する構造異常がくり返し生じていることから，この構造異常をもつ腫瘍細胞が免疫監視からの回避を介しクローン選択されていることが示された．そのため，同様のクローン選択および免疫回避の機構がほかの悪性腫瘍においても起こっているのではないかと仮説をたてた．それを検証するため，The Cancer Genome AtlasにRNA塩基配列のデータの登録されている33種類の悪性腫瘍からなる10,210例において，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ転写産物を検索した．その結果，12種類の悪性腫瘍において31例の症例が同定された．その多くにおいては，成人T細胞白血病と同様に，全ゲノム解析，エキソーム解析，あるいは，SNPアレイ法により異常な転写産物の原因となるゲノムの異常を同定された．この異常な転写産物は，とくに，びまん性大細胞型B細胞リンパ腫および胃がんにおいて高頻度に認められた．また，すべての例においてPD-L1遺伝子の過剰な発現が認められた．Hodgkinリンパ腫などにおいてPD-L1遺伝子のコピー数はその発現と相関することが示されているが4)，この関係は成人T細胞白血病，びまん性大細胞型B細胞リンパ腫，胃がんにおいても確認された．しかし，このPD-L1遺伝子のコピー数にかかわらず，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は有意かつ独立にPD-L1遺伝子の高発現と関連していた．
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例における抗腫瘍免疫を評価するため，The Cancer Genome Atlasコホートにおいて細胞融解活性スコアを評価した．このスコアは，細胞傷害性T細胞の浸潤および抗腫瘍免疫を表わす信頼性の高いマーカーであることが示されている9)．解析の結果，おのおのの腫瘍において細胞融解活性はPD-L1遺伝子の発現と有意に相関すること，さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつほとんどの症例において高い細胞融解活性を示すことが明らかにされた．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ腫瘍細胞は，PD-L1を恒常的に活性化させることにより抗腫瘍免疫の存在のもとクローン選択されるという仮説が支持された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においては，PD-L1遺伝子を同じ程度に発現する構造異常をもたない症例と比較して，有意に低い細胞融解活性を示した．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においては抗腫瘍免疫の減弱が起こっていることが示唆された．
ウイルスの感染はヒトのさまざまな悪性腫瘍における主要な原因であることが知られている．The Cancer Genome Atlasコホートの一部において，ウイルスのゲノムの挿入がPD-L1遺伝子の異常な発現の原因になっていると考えられた．すなわち，子宮頸がんの1例においてはヒトパイローマウイルス16のゲノムがPD-L1遺伝子座に挿入されており，その結果，PD-L1遺伝子のコピー数の増幅およびPD-L1遺伝子とウイルスのもつ遺伝子との融合が起こっていた．この発見にもとづき，The Cancer Genome AtlasコホートにおいてPD-L1遺伝子の内部あるいはその近傍におけるウイルスのゲノムの挿入について検索した．その結果，頭頸部がんの1例においてヒトパイローマウイルス16の挿入により同様の異常が認められた．この例は，PD-L1遺伝子の発現がもっとも高かったにもかかわらず，当初のスクリーニングではみのがされていたものであった．さらに，胃がんの1例においてはEpstein Barrウイルスのゲノムの挿入が認められたアレルの高度の増幅が起こりPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域において切断がひき起こされていた．これらの結果から，ウイルスが原因となる悪性腫瘍の一部においてはPD-L1遺伝子を標的とするウイルスのゲノムの挿入が起こっており，感染の初期において抗ウイルス免疫からの回避を促進するだけでなく，のちの抗腫瘍免疫からの回避にも寄与することが考えられた．
これらの発見にもとづき，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損がこれらの構造異常に関係するPD-L1遺伝子の過剰な発現の原因であると考えた．これを検証するため，CRISPR-Cas9技術を用いて，ヒトおよびマウスのさまざまな細胞株においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域のほぼ全体を標的として欠失あるいは逆位を導入し10)，PD-L1遺伝子の発現におよぼす影響について評価した．その結果，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の両端をおのおのの標的とするガイドRNAを導入した場合のみ，PD-L1遺伝子の高発現を示す細胞の画分が生じた．この画分を純化すると，PCR法および塩基配列の解読により想定したとおりのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠失あるいは逆位が認められ，PD-L1遺伝子をコードする転写産物およびPD-L1の顕著な高発現が示された．さらに，3’側非翻訳領域が切断された遺伝子をコードする転写産物は，野生型の転写産物と比較して分解の遅いことが明らかにされた．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域が転写産物の分解を負に制御する役割をもつことが示された．さらに，このPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の切断がその発現におよぼす影響は，既知のPD-L1の誘導タンパク質であるインターフェロンγ1) よりはるかに大きかった．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞をインターフェロンγにより刺激すると，PD-L1遺伝子の発現が相乗的に上昇した．これらの結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞はインターフェロンγを産生するT細胞の存在のもとでより効率的にPD-L1遺伝子の発現を上昇させて抗腫瘍免疫を回避することが可能であることが示された．
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損の生物学的な帰結について評価した．PC-9細胞にPD-L1遺伝子の3’-UTR側非翻訳領域の欠損を導入しPD-L1を恒常的に活性化させると，PD-1を発現させたT細胞にアポトーシスを誘導したが，この効果は抗PD-L1抗体により完全に阻害された．さらに，抗腫瘍免疫に対する効果をin vivoにおいて評価するため，マウスのリンパ腫細胞株であるEG7-OVA細胞を同系のマウスに移植し，ポリ(I：C) を投与して抗腫瘍免疫を惹起させる腫瘍退縮モデルを用いた．正常なPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域をもつEG7-OVA細胞を移植した場合，ポリ(I：C) の投与により腫瘍の退縮および腫瘍へのCD8陽性T細胞の浸潤が認められたが，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損を導入したEG7-OVA細胞を移植した場合には，腫瘍の退縮はほとんど認められずCD8陽性T細胞の浸潤も減弱していた．これらの結果から，PD-L1遺伝子に3’側非翻訳領域の構造異常をもつ細胞はPD-L/PD-L1シグナル伝達系を活性化させることにより，細胞傷害性T細胞の担う抗腫瘍免疫を回避することが可能であることが示唆され，実際に，抗PD-L1抗体により腫瘍の退縮およびCD8陽性T細胞の浸潤の回復が認められた．以上の結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常によるPD-L1の恒常的な活性化は腫瘍の増殖および免疫の回避を促進するのみならず，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は治療の標的となる可能性が示唆された．
この研究において，さまざまな悪性腫瘍においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に新規の構造異常が同定されたことから，PD-L1遺伝子の発現の制御における3’側非翻訳領域の重要性が示されると同時に，その異常によりがん細胞が免疫監視を回避する新たな分子機構をもつことが明らかにされた（図1）．ほとんどの腫瘍においてこのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は少数の症例にのみ存在したが，がんの全体としては多くの症例に認められ，BCR-ABL融合遺伝子やALK融合遺伝子とともに，ヒトの悪性腫瘍においてもっとも高頻度に存在する，がん遺伝子産物の活性化をひき起こす構造異常であると考えられた．さらに，もっとも重要なことは，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常により細胞は免疫監視を積極的に回避しており，それゆえ，抗PD-1/PD-L1抗体を用いた免疫チェックポイントの阻害療法に反応しやすい症例を同定するためのマーカーになりうることである．PD-L1遺伝子の遺伝学的な異常によりPD-L1が恒常的に活性化しているHodgkinリンパ腫における，抗PD-1/PD-L1抗体を用いた阻害療法の驚異的な奏効率をかんがみると11)，この可能性は早期に臨床試験において検証されるべきであろう．
略歴：2012年 東京大学大学院医学系研究科博士課程 修了，同年 同 特任助教を経て，2013年より京都大学大学院医学研究科 特定助教．
研究テーマ：造血器腫瘍の遺伝学的および生物学的な解析．
抱負：遺伝学的な基盤にもとづいた造血器腫瘍の発症機構の解明をめざしたい．
小川 誠司（Seishi Ogawa）
京都大学大学院医学研究科 教授．
研究室URL：http://plaza.umin.ac.jp/kyoto_tumorpatho/
© 2016 片岡圭亮・小川誠司 Licensed under CC 表示 2.1 日本
（京都大学大学院医学研究科 腫瘍生物学講座）
email：片岡圭亮
DOI: 10.7875/first.author.2016.050
Aberrant PD-L1 expression through 3'-UTR disruption in multiple cancers.
Keisuke Kataoka, Yuichi Shiraishi, Yohei Takeda, Seiji Sakata, Misako Matsumoto, Seiji Nagano, Takuya Maeda, Yasunobu Nagata, Akira Kitanaka, Seiya Mizuno, Hiroko Tanaka, Kenichi Chiba, Satoshi Ito, Yosaku Watatani, Nobuyuki Kakiuchi, Hiromichi Suzuki, Tetsuichi Yoshizato, Kenichi Yoshida, Masashi Sanada, Hidehiro Itonaga, Yoshitaka Imaizumi, Yasushi Totoki, Wataru Munakata, Hiromi Nakamura, Natsuko Hama, Kotaro Shide, Yoko Kubuki, Tomonori Hidaka, Takuro Kameda, Kyoko Masuda, Nagahiro Minato, Koichi Kashiwase, Koji Izutsu, Akifumi Takaori-Kondo, Yasushi Miyazaki, Satoru Takahashi, Tatsuhiro Shibata, Hiroshi Kawamoto, Yoshiki Akatsuka, Kazuya Shimoda, Kengo Takeuchi, Tsukasa Seya, Satoru Miyano, Seishi Ogawa
Nature, 534, 402-406 (2016)
要 約
進行がんを含むさまざまな悪性腫瘍における抗PD-1/PD-L1抗体による予後の改善は，発がんの過程における免疫回避の機構の重要性を示す．しかし，この免疫チェックポイントを介した免疫回避の機構の遺伝学的な基盤はほとんど明らかにされていない．筆者らは，この研究において，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に集積する構造異常による新たな免疫回避の機構について明らかにした．この構造異常は，成人T細胞白血病，びまん性大細胞型リンパ腫，胃がんを含むさまざまな悪性腫瘍において認められ，例外なく，3’側非翻訳領域の切断による転写産物の安定化を介したPD-L1遺伝子の異常な発現をともなっていた．さらに，さまざまな細胞株のゲノムにこの構造異常を導入すると，PD-L1遺伝子の発現の顕著な上昇およびin vivoにおける腫瘍の増殖や免疫回避の促進が認められたが，この効果は抗PD-L1抗体により阻害された．これらの結果から，免疫回避を介したクローン選択におけるPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の重要性のみならず，抗PD-1/PD-L1抗体の効果を予測する遺伝子マーカーとしてのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における構造異常の有用性が示唆された．
はじめに
進行がんを含むさまざまな悪性腫瘍における，抗PD-1/PD-L1抗体などの免疫チェックポイント阻害剤による患者の予後の改善は，発がんの過程における免疫回避の機構の重要性を示す1,2)．しかし，この免疫チェックポイントを介した免疫回避の機構の遺伝学的な基盤は，Hodgkinリンパ腫，一部のB細胞リンパ腫，胃がんなどにおいて認められるPD-L1遺伝子の高度の増幅およびプロモーター領域の置換をともなう染色体の転座のほか，ほとんど明らかではない3,4)．
転座，逆位，重複，欠失などの染色体の構造異常はがんのゲノムにおいて広く認められる5,6)．なかでも，最近，注目をあつめているのは，GFI1遺伝子やTERT遺伝子などのがんドライバー遺伝子の活性化の機構として報告されている非コード領域における構造異常である7)．しかし，その解析の困難さから，悪性腫瘍におけるゲノムの構造異常の全体像の解明はまだ途上である．
なお，がん免疫療法については，杉山大介・西川博嘉, 領域融合レビュー, 4, e005 (2015) も参照されたい．
1．成人T細胞白血病におけるPD-L1遺伝子の過剰な発現をともなう新規の構造異常の同定
そのようなゲノムの構造異常を同定するため新たな解析プラットフォームを開発し，49例の成人T細胞白血病の全ゲノムデータを再解析した8)（新着論文レビュー でも掲載）．その結果，13例においてPD-L1遺伝子座の3’側に切断点の集積する新規の構造異常が同定された．この構造異常は染色体の欠失，逆位，転座，重複などさまざまであったが，そのタイプにかかわらず，すべての例において異常なPD-L1遺伝子のアレルが形成されていた．12例においてはPD-L1遺伝子の3’側のエキソンが非コード領域の塩基配列と置換されており，1例においては最終エキソンにおいて327 bpの逆位が起こっていた．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつすべての症例において，PD-L1遺伝子の発現の顕著な上昇が認められた．原因となる構造異常から予測されたとおり，過剰に発現したPD-L1遺伝子をコードする転写産物のすべてに構造変化の起こっていることが，RNAシークエンス解析により確認された．10例においてはポリAシグナル配列を含むイントロンあるいは遺伝子間領域に由来する塩基配列がPD-L1遺伝子の5’側に融合しており，2例においてはもともとPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に存在する通常は使用されていないポリAシグナル配列による早期の転写終結が認められた．残りの1例においては3’側非翻訳領域において327 bpの逆位を起こした塩基配列に新たなポリAシグナル配列が形成され，予期せぬ転写終結がひき起こされていた．すなわち，これらのPD-L1遺伝子の異常な転写産物において，いずれも正常な3’側非翻訳領域が欠損していた．この結果，および，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつほとんどの症例においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における発現が欠損していたことから，正常な転写産物と比較して異常な転写産物が優位に存在することは明らかであり，このことは，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においてエキソン4と3’側非翻訳領域の発現比が顕著に高いことに反映されていた．
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例のうち，6例においてはPD-L1のORFが保たれていたが，残りの例においてはイントロン5あるいはイントロン6に切断点があり，PD-L1は途中で切断されていた．これらの異常なPD-L1にはすべての例において細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインが保たれており，細胞膜への発現およびPD-1との結合能は維持されていることが予想された．実際に，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例から得られた2種類の異常なPD-L1が，細胞膜への発現およびPD-1との結合能において正常なPD-L1と同様に機能することがフローサイトメトリー解析により確認された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ患者に由来する細胞においてもPD-L1が発現していること，および，構造異常をもたない患者に由来する細胞よりもはるかに高いPD-L1の発現を示すことが明らかにされた．逆に，PD-L1遺伝子の3’側の近傍に遺伝子がコードされるPD-1のもうひとつのリガンドであるPD-L2の発現はPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域における構造異常の有無により差が認められず，PD-L1遺伝子の構造異常はPD-L2遺伝子の発現には影響しないことが確認された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞においてはPD-1の結合能が増強しており，これは，過剰に発現したPD-L1に起因すると考えられた．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ患者におけるPD-L1の過剰な発現は免疫染色法およびウェスタンブロット法によっても確認された．
2．さまざまな悪性腫瘍におけるPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常の同定
PD-L1遺伝子の過剰な発現をともなう3’側非翻訳領域に集積する構造異常がくり返し生じていることから，この構造異常をもつ腫瘍細胞が免疫監視からの回避を介しクローン選択されていることが示された．そのため，同様のクローン選択および免疫回避の機構がほかの悪性腫瘍においても起こっているのではないかと仮説をたてた．それを検証するため，The Cancer Genome AtlasにRNA塩基配列のデータの登録されている33種類の悪性腫瘍からなる10,210例において，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ転写産物を検索した．その結果，12種類の悪性腫瘍において31例の症例が同定された．その多くにおいては，成人T細胞白血病と同様に，全ゲノム解析，エキソーム解析，あるいは，SNPアレイ法により異常な転写産物の原因となるゲノムの異常を同定された．この異常な転写産物は，とくに，びまん性大細胞型B細胞リンパ腫および胃がんにおいて高頻度に認められた．また，すべての例においてPD-L1遺伝子の過剰な発現が認められた．Hodgkinリンパ腫などにおいてPD-L1遺伝子のコピー数はその発現と相関することが示されているが4)，この関係は成人T細胞白血病，びまん性大細胞型B細胞リンパ腫，胃がんにおいても確認された．しかし，このPD-L1遺伝子のコピー数にかかわらず，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は有意かつ独立にPD-L1遺伝子の高発現と関連していた．
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例における抗腫瘍免疫を評価するため，The Cancer Genome Atlasコホートにおいて細胞融解活性スコアを評価した．このスコアは，細胞傷害性T細胞の浸潤および抗腫瘍免疫を表わす信頼性の高いマーカーであることが示されている9)．解析の結果，おのおのの腫瘍において細胞融解活性はPD-L1遺伝子の発現と有意に相関すること，さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつほとんどの症例において高い細胞融解活性を示すことが明らかにされた．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ腫瘍細胞は，PD-L1を恒常的に活性化させることにより抗腫瘍免疫の存在のもとクローン選択されるという仮説が支持された．さらに，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においては，PD-L1遺伝子を同じ程度に発現する構造異常をもたない症例と比較して，有意に低い細胞融解活性を示した．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ症例においては抗腫瘍免疫の減弱が起こっていることが示唆された．
3．固形がんにおけるウイルスのゲノムの挿入とPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常
ウイルスの感染はヒトのさまざまな悪性腫瘍における主要な原因であることが知られている．The Cancer Genome Atlasコホートの一部において，ウイルスのゲノムの挿入がPD-L1遺伝子の異常な発現の原因になっていると考えられた．すなわち，子宮頸がんの1例においてはヒトパイローマウイルス16のゲノムがPD-L1遺伝子座に挿入されており，その結果，PD-L1遺伝子のコピー数の増幅およびPD-L1遺伝子とウイルスのもつ遺伝子との融合が起こっていた．この発見にもとづき，The Cancer Genome AtlasコホートにおいてPD-L1遺伝子の内部あるいはその近傍におけるウイルスのゲノムの挿入について検索した．その結果，頭頸部がんの1例においてヒトパイローマウイルス16の挿入により同様の異常が認められた．この例は，PD-L1遺伝子の発現がもっとも高かったにもかかわらず，当初のスクリーニングではみのがされていたものであった．さらに，胃がんの1例においてはEpstein Barrウイルスのゲノムの挿入が認められたアレルの高度の増幅が起こりPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域において切断がひき起こされていた．これらの結果から，ウイルスが原因となる悪性腫瘍の一部においてはPD-L1遺伝子を標的とするウイルスのゲノムの挿入が起こっており，感染の初期において抗ウイルス免疫からの回避を促進するだけでなく，のちの抗腫瘍免疫からの回避にも寄与することが考えられた．
4．CRISPR-Cas9技術によるPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠失によりPD-L1の過剰な発現がひき起こされる
これらの発見にもとづき，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損がこれらの構造異常に関係するPD-L1遺伝子の過剰な発現の原因であると考えた．これを検証するため，CRISPR-Cas9技術を用いて，ヒトおよびマウスのさまざまな細胞株においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域のほぼ全体を標的として欠失あるいは逆位を導入し10)，PD-L1遺伝子の発現におよぼす影響について評価した．その結果，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の両端をおのおのの標的とするガイドRNAを導入した場合のみ，PD-L1遺伝子の高発現を示す細胞の画分が生じた．この画分を純化すると，PCR法および塩基配列の解読により想定したとおりのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠失あるいは逆位が認められ，PD-L1遺伝子をコードする転写産物およびPD-L1の顕著な高発現が示された．さらに，3’側非翻訳領域が切断された遺伝子をコードする転写産物は，野生型の転写産物と比較して分解の遅いことが明らかにされた．この結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域が転写産物の分解を負に制御する役割をもつことが示された．さらに，このPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の切断がその発現におよぼす影響は，既知のPD-L1の誘導タンパク質であるインターフェロンγ1) よりはるかに大きかった．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞をインターフェロンγにより刺激すると，PD-L1遺伝子の発現が相乗的に上昇した．これらの結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に構造異常をもつ細胞はインターフェロンγを産生するT細胞の存在のもとでより効率的にPD-L1遺伝子の発現を上昇させて抗腫瘍免疫を回避することが可能であることが示された．
5．PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損によるPD-L1の活性化は腫瘍の増殖および免疫の回避を促進する
PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損の生物学的な帰結について評価した．PC-9細胞にPD-L1遺伝子の3’-UTR側非翻訳領域の欠損を導入しPD-L1を恒常的に活性化させると，PD-1を発現させたT細胞にアポトーシスを誘導したが，この効果は抗PD-L1抗体により完全に阻害された．さらに，抗腫瘍免疫に対する効果をin vivoにおいて評価するため，マウスのリンパ腫細胞株であるEG7-OVA細胞を同系のマウスに移植し，ポリ(I：C) を投与して抗腫瘍免疫を惹起させる腫瘍退縮モデルを用いた．正常なPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域をもつEG7-OVA細胞を移植した場合，ポリ(I：C) の投与により腫瘍の退縮および腫瘍へのCD8陽性T細胞の浸潤が認められたが，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の欠損を導入したEG7-OVA細胞を移植した場合には，腫瘍の退縮はほとんど認められずCD8陽性T細胞の浸潤も減弱していた．これらの結果から，PD-L1遺伝子に3’側非翻訳領域の構造異常をもつ細胞はPD-L/PD-L1シグナル伝達系を活性化させることにより，細胞傷害性T細胞の担う抗腫瘍免疫を回避することが可能であることが示唆され，実際に，抗PD-L1抗体により腫瘍の退縮およびCD8陽性T細胞の浸潤の回復が認められた．以上の結果から，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常によるPD-L1の恒常的な活性化は腫瘍の増殖および免疫の回避を促進するのみならず，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は治療の標的となる可能性が示唆された．
おわりに
この研究において，さまざまな悪性腫瘍においてPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域に新規の構造異常が同定されたことから，PD-L1遺伝子の発現の制御における3’側非翻訳領域の重要性が示されると同時に，その異常によりがん細胞が免疫監視を回避する新たな分子機構をもつことが明らかにされた（図1）．ほとんどの腫瘍においてこのPD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常は少数の症例にのみ存在したが，がんの全体としては多くの症例に認められ，BCR-ABL融合遺伝子やALK融合遺伝子とともに，ヒトの悪性腫瘍においてもっとも高頻度に存在する，がん遺伝子産物の活性化をひき起こす構造異常であると考えられた．さらに，もっとも重要なことは，PD-L1遺伝子の3’側非翻訳領域の構造異常により細胞は免疫監視を積極的に回避しており，それゆえ，抗PD-1/PD-L1抗体を用いた免疫チェックポイントの阻害療法に反応しやすい症例を同定するためのマーカーになりうることである．PD-L1遺伝子の遺伝学的な異常によりPD-L1が恒常的に活性化しているHodgkinリンパ腫における，抗PD-1/PD-L1抗体を用いた阻害療法の驚異的な奏効率をかんがみると11)，この可能性は早期に臨床試験において検証されるべきであろう．
文 献
- Topalian, S. L., Drake, C. G. & Pardoll, D. M.: Immune checkpoint blockade: a common denominator approach to cancer therapy. Cancer Cell, 27, 450-461 (2015)[PubMed]
- Page, D. B., Postow, M. A., Callahan, M. K. et al.: Immune modulation in cancer with antibodies. Annu. Rev. Med., 65, 185-202 (2014)[PubMed]
- Steidl, C., Shah, S. P., Woolcock, B. W. et al.: MHC class II transactivator CIITA is a recurrent gene fusion partner in lymphoid cancers. Nature, 471, 377-381 (2011)[PubMed]
- Green, M. R., Monti, S., Rodig, S. J. et al.: Integrative analysis reveals selective 9p24.1 amplification, increased PD-1 ligand expression, and further induction via JAK2 in nodular sclerosing Hodgkin lymphoma and primary mediastinal large B-cell lymphoma. Blood, 116, 3268-3277 (2010)[PubMed]
- Mertens, F., Johansson, B., Fioretos, T. et al.: The emerging complexity of gene fusions in cancer. Nat. Rev. Cancer, 15, 371-381 (2015)[PubMed]
- Garraway, L. A. & Lander, E. S.: Lessons from the cancer genome. Cell, 153, 17-37 (2013)[PubMed]
- Northcott, P. A., Lee, C., Zichner, T. et al.: Enhancer hijacking activates GFI1 family oncogenes in medulloblastoma. Nature, 511, 428-434 (2014)[PubMed]
- Kataoka, K., Nagata, Y., Kitanaka, A. et al.: Integrated molecular analysis of adult T cell leukemia/lymphoma. Nat. Genet., 47, 1304-1315 (2015)[PubMed] [新着論文レビュー]
- Rooney, M. S., Shukla, S. A., Wu, C. J. et al.: Molecular and genetic properties of tumors associated with local immune cytolytic activity. Cell, 160, 48-61 (2015)[PubMed]
- Maddalo, D., Manchado, E., Concepcion, C. P. et al.: In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system. Nature, 516, 423-427 (2014)[PubMed]
- Ansell, S. M., Lesokhin, A. M., Borrello, I. et al.: PD-1 blockade with nivolumab in relapsed or refractory Hodgkin's lymphoma. N. Engl. J. Med., 372, 311-319 (2015)[PubMed]
活用したデータベースにかかわるキーワードと統合TVへのリンク
著者プロフィール
略歴：2012年 東京大学大学院医学系研究科博士課程 修了，同年 同 特任助教を経て，2013年より京都大学大学院医学研究科 特定助教．
研究テーマ：造血器腫瘍の遺伝学的および生物学的な解析．
抱負：遺伝学的な基盤にもとづいた造血器腫瘍の発症機構の解明をめざしたい．
小川 誠司（Seishi Ogawa）
京都大学大学院医学研究科 教授．
研究室URL：http://plaza.umin.ac.jp/kyoto_tumorpatho/
© 2016 片岡圭亮・小川誠司 Licensed under CC 表示 2.1 日本
