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自然リンパ球は腸管上皮細胞の糖鎖修飾を制御する

2014年9月24日

後藤義幸・清野 宏
(東京大学医科学研究所 炎症免疫学分野)
email:後藤義幸清野 宏
DOI: 10.7875/first.author.2014.121

Innate lymphoid cells regulate intestinal epithelial cell glycosylation.
Yoshiyuki Goto, Takashi Obata, Jun Kunisawa, Shintaro Sato, Ivaylo I. Ivanov, Aayam Lamichhane, Natsumi Takeyama, Mariko Kamioka, Mitsuo Sakamoto, Takahiro Matsuki, Hiromi Setoyama, Akemi Imaoka, Satoshi Uematsu, Shizuo Akira, Steven E. Domino, Paulina Kulig, Burkhard Becher, Jean-Christophe Renauld, Chihiro Sasakawa, Yoshinori Umesaki, Yoshimi Benno, Hiroshi Kiyono
Science, 345, 1254009 (2014)

要 約

 腸管はつねに多種多様な外来の抗原にさらされる特殊な器官である.それらの外来抗原が最初に到達する腸管上皮細胞は,それをおおう粘液層とともに第一線の防御バリアを形成している.腸管上皮細胞はさまざまな糖鎖および糖転移酵素を発現しており,それらのなかでは糖鎖の末端にフコースを付加する2型フコース転移酵素も発現している.2型フコース転移酵素をコードする遺伝子の不活性型の変異についてはヒトにおいて感染症,クローン病,糖尿病などさまざまな疾患とのかかわりが指摘されているものの,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現の誘導機構の詳細はほとんど明らかにされていない.この研究では,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現にセグメント細菌を含む腸内細菌,および,インターロイキン22やリンホトキシンを産生する3型自然リンパ球が関与していることが見い出された.さらに,2型フコース転移酵素のノックアウトマウスはSalmonella typhimuriumに感染しやすいことが示されたことから,3型自然リンパ球により発現が誘導される2型フコース転移酵素,および,腸管上皮細胞から産生されるフコースはS. typhimuriumの感染に対し防御機能をもつことが示された.これらの結果から,3型自然リンパ球による,腸管上皮細胞の糖鎖修飾を介した新規の自然免疫応答の存在が示された.

はじめに

 腸管は腸管上皮細胞と粘膜固有層から構成され,腸内細菌および病原性細菌や食餌に由来する外来の抗原につねにさらされている.これら多種多様な外来抗原に対し,腸管には有害なものは排除し無害なものには寛容になる免疫系が備わっており,腸管および腸管関連リンパ組織に存在する免疫細胞がその指揮系統をつかさどると考えられている.腸管上皮細胞は体の内と外を分けへだて,外来抗原の体内への直接的な侵入を物理的に制御している.腸管上皮細胞は多くの糖鎖および糖転移酵素を発現しており,とくに,糖鎖の末端に付加されるフコースは病原性のウイルスや細菌と結合することが示されている1).腸管上皮細胞の表面に存在するフコースはフコース転移酵素のひとつである2型フコース転移酵素により制御されている1).近年,2型フコース転移酵素をコードする遺伝子のヒトにおける不活性型の変異は,クローン病だけでなく糖尿病や原発性硬化性胆管炎など慢性炎症性疾患に関連することが報告されている2-4).しかしながら,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現の誘導機構についてはほとんど明らかにされていない.また,腸管上皮細胞の表面に存在するフコースは腸内細菌であるBacteroides属細菌の栄養源として利用されることも報告されており,腸内細菌との共生因子のひとつであることが示唆されている5).このような背景から,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現の誘導機構およびフコースの付加の制御機構の解明は,生物学的および医学的に重要な命題といえる.

1.セグメント細菌は腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する

 フコースを発現する上皮細胞はおもに腸管に観察されるが,その動態や発現の誘導機構など,いまだ不明な点が多い.はじめに,小腸においてフコシル化された上皮細胞の分布を調べた.その結果,十二指腸の側にはフコシル化された上皮細胞はほとんど観察されないのに対し,回腸の側には多くのフコシル化された上皮細胞が恒常的に存在することが見い出された.腸内フローラは十二指腸から回腸に進むにしたがいその数や種類が変化するので,腸内細菌と腸管上皮細胞のフコシル化との関係を調べるため,無菌マウスおよび抗生物質を処理したマウスの回腸を観察したところ,腸管上皮細胞のフコシル化,および,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現はほぼ完全に消失していた.このことから,腸管上皮細胞のフコシル化の誘導および維持に腸内細菌が関与することが明らかになった.
 腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する細菌を同定する目的で,十二指腸および回腸の腸内フローラを16S rRNA遺伝子クローンライブラリー法を用いて解析した.その結果,十二指腸の側ではLactobacillus属細菌が,回腸の側ではセグメント細菌が最優勢であった.セグメント細菌はグラム陽性の偏性嫌気性細菌であり,Th17細胞および免疫グロブリンA産生細胞の分化,上皮間リンパ球の増殖など,腸管における免疫細胞の分化や増殖を誘導する6).さらに,アンピシリンおよびバンコマイシンの処理によりセグメント細菌を除去すると腸管上皮細胞のフコシル化が消失したことから,セグメント細菌が腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する細菌のひとつである可能性が考えられた.この可能性を検証するため,無菌マウス,セグメント細菌を投与した無菌マウス,Lactobacillus murinusを投与した無菌マウスのそれぞれの腸管上皮細胞を解析したところ,セグメント細菌を投与した無菌マウスでのみ腸管上皮細胞のフコシル化が観察された.以上の結果から,セグメント細菌が腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する細菌であることが示された.

2.自然リンパ球は腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する

 セグメント細菌による腸管上皮細胞のフコシル化の誘導経路として,セグメント細菌が腸管上皮細胞に直接的に作用してフコシル化を誘導する,あるいは,セグメント細菌が免疫細胞を介して腸管上皮細胞にシグナルを伝達しそのフコシル化を誘導する,という2つの可能性が考えられた.これまでに,Bacteroides属細菌と腸管上皮細胞の二者のあいだで腸管上皮細胞のフコシル化が誘導されるモデルが提唱されていたものの5),セグメント細菌を含む腸内細菌には,Th17細胞および免疫グロブリンA産生細胞の分化,上皮間リンパ球の増殖,自然リンパ球からのサイトカインの産生の誘導という機能が報告されていたため6),免疫細胞がセグメント細菌からの刺激をうけて腸管上皮細胞のフコシル化を誘導するという仮説をたてた.
 この仮説を検証するため,T細胞を欠失したマウスおよびB細胞を欠失したマウスの腸管上皮細胞を観察した.その結果,これらのマウスにおいて腸管上皮細胞のフコシル化の低下は観察されなかった.Th17細胞および3型自然リンパ球を欠失したRorγtノックアウトマウスを解析したところ,腸管上皮細胞のフコシル化,および,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現はほぼ完全に消失していた.一方,Th17細胞を欠失しているインターロイキン6ノックアウトマウスには野生型マウスと同等の腸管上皮細胞のフコシル化が観察されたことから,Th17細胞は腸管上皮細胞のフコシル化の誘導には必要でないことが明らかになった.
 以上の結果より,3型自然リンパ球が腸管上皮細胞のフコシル化の誘導に関与することが示唆された.Ragノックアウトマウスでは3型自然リンパ球の数が増加していることが知られている7).Ragノックアウトマウスを解析したところ,3型自然リンパ球の増加と相関してフコシル化した腸管上皮細胞の数も上昇していた.3型自然リンパ球はCD90抗原を高発現しており,抗CD90抗体により3型自然リンパ球を選択的に除去することができる.そこで,野生型マウスおよびRagノックアウトマウスを抗CD90抗体により処理すると,腸管上皮細胞のフコシル化もほぼ完全に消失した.一方,Rorγtノックアウトマウスおよび抗CD90抗体を処理したRagノックアウトマウスの回腸に存在するセグメント細菌の数は,野生型マウスと同等あるいは増加していた.つまり,セグメント細菌が存在していても,3型自然リンパ球が欠失することにより腸管上皮細胞のフコシル化は消失した.以上の結果から,腸管上皮細胞のフコシル化には3型自然リンパ球が必要であることが明らかになった.

3.自然リンパ球が産生するインターロイキン22は腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する

 3型自然リンパ球は腸内細菌に依存してインターロイキン22を産生することが知られている8).3型自然リンパ球が腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する分子機構を明らかにするため,十二指腸および回腸に存在する3型自然リンパ球からmRNAを抽出しインターロイキン22をコードする遺伝子の発現を比較したところ,回腸に存在する3型自然リンパ球においてインターロイキン22の発現が有意に高く,抗生物質の処理によりその発現は低下し,フコシル化した腸管上皮細胞の数と相関した.そこで,インターロイキン22ノックアウトマウスの回腸を解析したところ,腸管上皮細胞のフコシル化はほぼ消失していることが見い出された.インターロイキン22が腸管上皮細胞のフコシル化の誘導に対し十分条件となりうるかを調べるため,抗生物質を処理した野生型マウスおよびRorγtノックアウトマウスにおいてインターロイキン22を一時的に高発現させたところ,腸管上皮細胞のフコシル化が誘導された.つまり,腸内細菌および3型自然リンパ球が存在しない環境においても,インターロイキン22が存在しさえすれば腸管上皮細胞のフコシル化が誘導されることが明らかになった.3型自然リンパ球の産生するインターロイキン22が腸管上皮細胞のフコシル化を誘導および維持している可能性を検証するため,Ragノックアウトマウスを抗インターロイキン22中和抗体により処理したところ,腸管上皮細胞のフコシル化,および,腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現が有意に低下した.以上の結果から,3型自然リンパ球が産生するインターロイキン22は腸管上皮細胞のフコシル化を誘導および維持することが明らかになった(図1).

figure1

4.自然リンパ球が産生するリンホトキシンは腸管上皮細胞のフコシル化を誘導する

 3型自然リンパ球はインターロイキン22にくわえリンホトキシンを産生することにより,宿主における2次リンパ組織の形成および維持に寄与している9).実際に,腸管において3型自然リンパ球はほかの細胞と比較してリンホトキシンαおよびリンホトキシンβを高発現していた.一方,インターロイキン22とは異なり,3型自然リンパ球によるリンホトキシンの産生は抗生物質を処理したマウスと野生型マウスとで同等であった.このことから,3型自然リンパ球は腸内細菌に非依存的にリンホトキシンを恒常的に産生していた.リンホトキシンαノックアウトマウスを解析したところ,腸管上皮細胞のフコシル化,および腸管上皮細胞における2型フコース転移酵素の発現はほぼ完全に消失していた.リンホトキシンαノックアウトマウスは2次リンパ節の形成が不全であることから,2次リンパ節の存在が腸管上皮細胞のフコシル化の誘導に関与している可能性が考えられた.しかしながら,パイエル板を欠失したマウスにおいては腸管上皮細胞のフコシル化は低下しないこと,および,2次リンパ節の成熟している成体マウスのリンホトキシンシグナルを阻害すると腸管上皮細胞のフコシル化が低下したことから,腸管上皮細胞のフコシル化は2次リンパ節そのものには依存しないが,リンホトキシンには依存していると考えられた.3型自然リンパ球が産生するリンホトキシンが腸管上皮細胞のフコシル化を誘導している可能性を検証するため,混合骨髄移植マウスを作製した.その結果,リンホトキシンを発現する3型自然リンパ球をもつマウスでは腸管上皮細胞のフコシル化が誘導されるのに対し,リンホトキシンを欠損した3型自然リンパ球をもつマウスでは腸管上皮細胞のフコシル化は誘導されなかった.以上の結果から,3型自然リンパ球の産生するリンホトキシンは腸管上皮細胞のフコシル化の誘導に必要であることが明らかになった.

5.腸管上皮細胞から産生されるフコースはSalmonella typhimuriumの感染を阻害する

 腸管上皮細胞から産生されるフコースはノロウイルスやロタウイルスの受容体として利用されるのみならず,Bacteroides属細菌の栄養源として利用されていることが知られている1,5).一方,病原性細菌に対する腸管上皮細胞から産生されるフコースの作用については,いまだ明らかになっていない.病原性細菌に対する腸管上皮細胞の応答を観察したところ,無菌マウスに病原性細菌であるSalmonella typhimuriumを感染させると,腸管上皮細胞のフコシル化が高頻度に観察され,それにともない,2型フコース転移酵素の発現も大きく上昇していた.一方,RorγtノックアウトマウスにS. typhimuriumを感染させても腸管上皮細胞のフコシル化は誘導されなかったことから,この反応にも3型自然リンパ球が関与していると考えられた.そこで,S. typhimuriumの感染に対する腸管上皮細胞から産生されるフコースの機能を解析するため,2型フコース転移酵素のノックアウトマウスにS. typhimuriumを感染させた.その結果,2型フコース転移酵素ノックアウトマウスでは野生型マウスに比べ,S. typhimuriumの感染により激しい炎症が起こり,多くの炎症性細胞が浸潤することが見い出された.さらに,腸管の内容物および腸管組織に存在するS. typhimuriumを計数したところ,腸管の内容物については野生型マウスと2型フコース転移酵素ノックアウトマウスのあいだで差はみられなかったのに対し,腸管組織に存在するS. typhimuriumの数は2型フコース転移酵素ノックアウトマウスにおいて有意に増加していた.このことから,腸管上皮細胞から産生されるフコースはS. typhimuriumの腸管組織への感染を阻害するはたらきをもつことが示唆された.実際に,腸管において発現が確認されるフコシル化糖鎖であるH2型抗原は,in vitroの実験系において腸管上皮細胞へのS. typhimuriumの結合を阻害することが報告されている10).生体の腸管においてはH2型抗原がつねに産生されており,これらH2型抗原がS. typhimuriumの腸管上皮細胞への侵入を阻害しているものと考えられた.以上のことから,3型自然リンパ球により誘導および制御されている腸管上皮細胞から産生されるフコースはS. typhimuriumの感染を阻害する機能をもつことが示された(図1).

おわりに

 この研究では,未解明であった腸管上皮細胞のフコシル化の誘導機構に,セグメント細菌を含む腸内細菌,および,インターロイキン22およびリンホトキシンを産生する3型自然リンパ球が関与することが明らかにされた.とくに,3型自然リンパ球によるインターロイキン22の産生は腸内細菌に依存的であり,リンホトキシンの産生は腸内細菌に非依存的であったことから,腸管上皮細胞のフコシル化および2型フコース転移酵素の発現は,3型自然リンパ球により産生されるインターロイキン22およびリンホトキシンにより2段階の制御をうけていることが示された(図1).これまで,腸管上皮細胞のフコシル化はBacteroides属細菌と腸管上皮細胞の二者のあいだで制御されていると考えられてきたが,この研究により,代表的な腸管免疫細胞のひとつである3型自然リンパ球が腸管上皮細胞のフコシル化に必須の役割を担っていること,3型自然リンパ球により誘導される腸管上皮細胞から産生されるフコースはS. typhimuriumの組織への侵入を阻害していることが明らかになった(図1).これらの結果から,3型自然リンパ球による新たな腸管上皮細胞の糖鎖修飾および感染防御の分子機構が示された.2型フコース転移酵素をコードする遺伝子の不活性型の変異は,ヒトにおいて,クローン病,ノロウイルスの感染,糖尿病など,さまざまな疾患に関与することが報告されている1-4).今後は,腸管上皮細胞におけるフコースの発現を制御することが,これらの疾患に対する新規の治療法,診断法,予防法の開発につながると期待される.

文 献

  1. Goto, Y. & Kiyono, H.: Epithelial barrier: an interface for the cross-communication between gut flora and immune system. Immunol. Rev., 245, 147-163 (2012)[PubMed]
  2. Franke, A., Balschun, T., Sina, C. et al.: Genome-wide association study for ulcerative colitis identifies risk loci at 7q22 and 22q13 (IL17REL). Nat. Genet., 42, 292-294 (2010)[PubMed]
  3. Smyth, D.,J., Cooper, J. D., Howson, J. M. et al.: FUT2 nonsecretor status links type 1 diabetes susceptibility and resistance to infection. Diabetes, 60, 3081-3084 (2011)[PubMed]
  4. Folseraas, T., Melum, E., Rausch, P. et al.: Extended analysis of a genome-wide association study in primary sclerosing cholangitis detects multiple novel risk loci. J. Hepatol., 57, 366-375 (2012)[PubMed]
  5. Comstock, L. E. & Kasper, D. L.: Bacterial glycans: key mediators of diverse host immune responses. Cell, 126, 847-850 (2006)[PubMed]
  6. Honda, K. & Littman D. R.: The microbiome in infectious disease and inflammation. Annu. Rev. Immunol., 30, 759-795 (2012)[PubMed]
  7. Sawa, S., Lochner, M., Satoh-Takayama, N. et al.: RORγt+ innate lymphoid cells regulate intestinal homeostasis by integrating negative signals from the symbiotic microbiota. Nat. Immunol., 12, 320-326 (2011)[PubMed] [新着論文レビュー]
  8. Sanos, S.L., Bui, V. L., Mortha, A. et al.: RORγt and commensal microflora are required for the differentiation of mucosal interleukin 22-producing NKp46+ cells. Nat. Immunol., 10, 83-91 (2009)[PubMed]
  9. Spits, H., Artis, D., Colonna, M. et al.: Innate lymphoid cells: a proposal for uniform nomenclature. Nat. Rev. Immunol., 13, 145-149 (2013)[PubMed]
  10. Chessa, D., Winter, M. G., Jakomin, M. et al.: Salmonella enterica serotype Typhimurium Std fimbriae bind terminal α(1,2)fucose residues in the cecal mucosa. Mol. Microbiol., 71, 864-875 (2009)[PubMed]

生命科学の教科書における関連するセクションへのリンク

東京大学 大学院総合文化研究科・教養学部附属教養教育高度化機構自然科学教育高度化部門から公開されている生命科学の教科書 “A Comprehensive Approach To LIFE SCIENCE”(羊土社『理系総合のための生命科学 第2版』の英語版)における関連するセクションへのリンクです.

著者プロフィール

後藤 義幸(Yoshiyuki Goto)
略歴:2009年 東京大学大学院医学系研究科博士課程 修了,同年 東京大学医科学研究所 博士研究員を経て,2013年より米国Columbia大学Medical Center博士研究員.
研究テーマ:腸内細菌による宿主の粘膜における免疫機構の構築.
関心事:宿主の免疫細胞による腸内細菌叢の恒常性の維持および腸内細菌による宿主の免疫の構築の機構.腸内細菌と宿主とのあいだで共生関係が成立するシステム.

清野 宏(Hiroshi Kiyono)
東京大学医科学研究所 教授.
研究室URL:http://www.ims.u-tokyo.ac.jp/EnMen/index_j.html

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