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小胞型モノアミン輸送体VMAT2は膵臓β細胞の分化を制御する

坂野大介・粂 昭苑
(熊本大学発生医学研究所 多能性幹細胞分野)
email:坂野大介粂 昭苑
DOI: 10.7875/first.author.2014.005

VMAT2 identified as a regulator of late-stage β-cell differentiation.
Daisuke Sakano, Nobuaki Shiraki, Kazuhide Kikawa, Taiji Yamazoe, Masateru Kataoka, Kahoko Umeda, Kimi Araki, Di Mao, Shirou Matsumoto, Naomi Nakagata, Olov Andersson, Didier Stainier, Fumio Endo, Kazuhiko Kume, Motonari Uesugi, Shoen Kume
Nature Chemical Biology, 10, 141-148 (2014)




要 約


 ES細胞やiPS細胞などの多能性幹細胞を糖尿病の治療に応用するにあたっては,機能的な膵臓β細胞への分化を低コストで誘導することが必要である.しかしながら,この技術の開発はその分子機構に関する知識の不足のため進んでいない.筆者らは,膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化を促進する薬剤として,小胞モノアミン輸送体のひとつVMAT2の阻害剤であるレセルピンおよびテトラベナジンを同定した.VMAT2により小胞への取り込みが制御されるドーパミン,ヒスタミン,セロトニンなどモノアミンは,膵臓β細胞への分化を抑制した.また,レセルピンやテトラベナジンは細胞透過性のcAMP類似体であるジブチリルcAMPとの相乗効果により,in vitroにおいてES細胞をグルコースに依存性のインスリン分泌能を示す成熟した膵臓β細胞へと分化させた.ES細胞に由来する膵臓β細胞を糖尿病のモデルマウスに移植したところ,血糖値が正常値へと低下した.今回の研究成果は,多能性幹細胞を用いた将来的な再生医療に貢献する可能性がある.

はじめに


 膵臓の発生の過程では,膵臓前駆細胞をへて,外分泌細胞,膵管,内分泌細胞が分化する.内分泌前駆細胞は転写因子Ngn3の一過性の発現により特徴づけられる.以前の研究において,Ngn3が欠損すると内分泌細胞は分化しないことが示されている.膵臓のランゲルハンス島を構成する内分泌細胞への細胞運命の決定は複数の転写因子の協調した活性化を介し進行するが,その制御機構に関しては不明な点が多い.最近の研究では,マウスやヒトのES細胞およびiPS細胞から膵臓β細胞の分化を発生と同じ細胞系譜をたどりながら誘導することが可能になった.これまでの研究では,おもに成長因子を用いた手法,そして近年では,大規模スクリーニングにより発見された低分子化合物を用いて,ES細胞から内胚葉,さらに,膵臓前駆細胞へ効率的に分化を誘導できることが示されている.しかし,これらの手法を用いてさらに分化を進め,インスリン産生細胞を分化させたとしても,グルコースに依存性のインスリン分泌能の獲得はいまだ困難である.発生において膵臓前駆細胞,内分泌前駆細胞,インスリン産生細胞が分化し,さらにグルコースに依存性のインスリン分泌能をもつ成熟した膵臓β細胞が分化するには,どのような分子機構によるのか,より深い理解が必要である.

1.低分子化合物の大規模スクリーニングによる分化を促進する薬剤としてのレセルピンおよびテトラベナジンの同定


 Pdx1遺伝子のプロモーター下でGFPを発現するES細胞株であるSK7 ES細胞を用いて,低分子化合物の大規模スクリーニングを行った.このSK7 ES細胞は17日間の培養の過程において,発生の過程を模倣するようにSox17遺伝子,Pdx1遺伝子,Ngn3遺伝子,Ins1遺伝子を順に発現した.Pdx1は膵臓前駆細胞において1回目の発現のピークを示し,内分泌前駆細胞において発現は低下するが,インスリンを発現する膵臓β細胞においてふたたび発現のピークを示す転写因子である.今回は,Pdx1陽性の膵臓前駆細胞からPdx1陽性かつインスリン陽性の二重陽性を示す膵臓β細胞への分化を促進するという指標によりスクリーニングを行った.このため,Pdx1陽性かつインスリン陰性を示す膵臓前駆細胞の数が最大になる培養11日目よりあとに低分子化合物を添加した.合計1120の化合物ライブラリーについてスクリーニングし,Pdx1陽性の細胞の数とPdx1陽性かつインスリン陽性の細胞の数の変化を指標としてヒット化合物の同定を試みた.用いた分化培養系における変動係数は約0.36と,一般的な低分子化合物スクリーニングと比較して高い値であったため,さらに薬剤の効果の濃度依存性を確認する二次スクリーニングを行うことによりヒット化合物を同定した.
 ヒット化合物のうち,血圧降下作用,鎮静作用,精神安定作用をもつアルカロイドの一種であるレセルピンがもっとも高いインスリン産生細胞への分化の誘導効果を示した.レセルピンはPdx1陽性細胞の比率を変化させることなく,濃度に依存的にPdx1陽性かつインスリン陽性の細胞の割合を増加させた.また,レセルピンと同じく小胞モノアミン輸送体のひとつであるVMAT2(vesicular monoamine transporter 2)の阻害剤として知られるテトラベナジンも,レセルピンと同様の効果を示した.この結果は,VMAT2の阻害が膵臓前駆細胞から膵臓β細胞への分化を促進することを示唆した.

2.VMAT2は膵臓β細胞への分化を抑制する


 小胞モノアミン輸送体であるVMAT2は膵臓β細胞への分化に関しどのような役割があるかを調べる目的で,VMAT2をノックダウンしたES細胞株を樹立した.このES細胞株はレセルピンやテトラベナジンを添加したときと同じくインスリン産生細胞への分化を促進し,ノックダウンの効率が高いほど分化の促進効果は高かった.したがって,VMAT2が小胞へモノアミンを取り込む機能は膵臓β細胞の分化に抑制的な効果をもつものと推察した.
 一般的に,モノアミンは細胞においてVMAT2により小胞に取り込まれないときにはモノアミンオキシダーゼにより分解される.膵臓のランゲルハンス島にはモノアミンオキシダーゼBが発現している.ES細胞からの分化の過程において,細胞質におけるモノアミンの量を増加させるためモノアミンオキシダーゼBの阻害剤を添加したところ,分化するインスリン産生細胞の数が減少した.また,この作用はレセルピンを同時に添加することでレスキューされた.そして,モノアミンであるドーパミン,セロトニン,ヒスタミンを培養11日目から培養17日目にかけて添加した場合も,モノアミンオキシダーゼBの阻害と同様にインスリン産生細胞への分化が抑制された.この結果に対し,ドーパミン合成酵素の阻害剤,セロトニン合成酵素の阻害剤,ヒスタミン合成酵素の阻害剤によりインスリン産生細胞の数は増加した.これらの結果から,細胞においてVMAT2により小胞に取り込まれるモノアミンは膵臓β細胞への分化を抑制的に制御していることが推定された.

3.VMAT2の機能の阻害は内分泌前駆細胞を増加させる


 テトラベナジンを培養11日目から培養17日目まで作用させてVMAT2を阻害すると,膵臓の細胞系譜への分化におけるマーカー遺伝子であるNgn3遺伝子,Nkx6.1遺伝子,Ins1遺伝子の発現が培養15日目から培養17日目において明らかに上昇した.テトラベナジンの効果のある時期を特定するため,Ngn3遺伝子のプロモーター下においてGFPの発現するマウスのES細胞を用いて実験したところ,テトラベナジンは分化11日目から分化13日目において作用してNgn3陽性の膵臓前駆細胞を増加させることがわかった.すなわち,VMAT2の阻害は膵臓前駆細胞がNgn3陽性の内分泌前駆細胞へと分化する過程を促進することがわかった.また,分化の過程においてNgn3陽性細胞の数が増加することについて,Ngn3陽性細胞それ自体の複製はほとんど起こっておらず,Ngn3陽性細胞への分化の促進がそのおもな原因であると考えられた.
 これらES細胞からの分化の過程においてみられるVMAT2の阻害にともなう分化の促進効果は,実際の膵臓の発生においても共通するのか調べるため,胎生12.5日の膵臓の原基をマウスの胎仔から取り出し培養した.実験の結果,テトラベナジンにより,インスリン,グルカゴン,ソマトスタチン,膵臓ポリペプチドなど,内分泌ホルモンの発現がすべて上昇した.これらの結果は,ES細胞からの分化の実験においてテトラベナジンによりVMAT2の機能を阻害すると内分泌前駆細胞の数が増加したことと一致した.

4.VMAT2の阻害とcAMPの添加は相乗効果を示す


 モノアミンであるドーパミン,セロトニン,ヒスタミンは,すべてGタンパク質共役受容体に結合しcAMPの合成を制御することが知られている.今回のスクリーニングにおいても細胞膜透過型のcAMP類似体であるジブチリルcAMPがヒットし,ジブチリルcAMPとテトラベナジンはそれぞれ単独でインスリン産生細胞への分化を促進した.そして,両者を同時に添加すると,インスリン産生細胞の数の増加に対しては相加的に,インスリンのmRNAレベルでの発現の上昇に対しては相乗的に,促進効果を示した.成体の膵臓β細胞ではcAMPはプロテインキナーゼAに対し依存性および非依存性の機構によりインスリンの分泌を制御していることが知られている1).この研究ではおもにジブチリルcAMPを用いたが,これはどちらの機構も活性化させるので,プロテインキナーゼA非依存性の経路のみを活性化させる8CPT-cAMPの効果を調べた.すると,8CPT-cAMPの添加によりインスリン陽性細胞の数は増加しなかった.したがって,cAMPによるインスリン産生細胞の数の増加はプロテインキナーゼA依存性の機構を介するものと推定された.
 テトラベナジンおよびジブチリルcAMPにより誘導されたインスリン産生細胞を評価するため免疫染色を行った.インスリン陽性細胞はPdx1遺伝子,Nkx2.2遺伝子,Nkx6.1遺伝子,MafA遺伝子など,膵臓β細胞が成熟の過程において発現するマーカー遺伝子を発現していた.さらに,今回の分化培養系によりDBA陽性を示す膵管細胞の分化は誘導されたが,アミラーゼ陽性を示す外分泌細胞の分化はみられなかった.しかも,低分子化合物の添加により分化する細胞の性質に違いはみられなかった.ほかの内分泌ホルモンについても染色を行ったところ,インスリン陽性細胞のうち約90%がグルカゴン,ソマトスタチン,膵臓ポリペプチドのうちいくつかを同時に産生していた.このような複数のホルモンを産生するインスリン産生細胞がつくられたことは,最近,ヒトのES細胞の分化の過程においても報告されている2)
 これらのインスリン産生細胞はインスリンを分泌することができるだろうか.分化したインスリン産生細胞のインスリン合成能や分泌能に関して,細胞の含有するインスリンの量および分泌されたインスリンの量を測定するため,インスリンCペプチドに対するELISA法を用いた.また,Pdx1は膵臓前駆細胞において発現し,内分泌前駆細胞においてはいったん発現が低下し,膵臓β細胞になるとふたたび発現が上昇する.そして,17日間にわたり培養するとほとんどのPdx1陽性細胞はインスリン陽性との二重陽性を示したことから,Pdx1陽性細胞をフローサイトメトリーにより分取したところ,テトラベナジンおよびジブチリルcAMPの添加により,全体の約10%の細胞がPdx1陽性を示す膵臓β細胞として回収された.ELISA法による測定の結果,テトラベナジンの添加により細胞あたりのインスリンCペプチドの含量はマウスのランゲルハンス島の60%に相当していた.しかし,テトラベナジンの添加はグルコースに依存性のインスリン分泌には影響しなかった.一方,培養11日目から17日目にかけてジブチリルcAMPを添加することによりグルコースに依存性のインスリンの分泌がみられた.これらの結果は,cAMPによりインスリン産生細胞の成熟が進行しグルコースに依存性のインスリン分泌能を獲得したことを示唆した.ELISA法による測定の結果,ジブチリルcAMPの添加により細胞あたりのインスリン分泌能はマウスのランゲルハンス島の40%程度に相当しており,先行研究と比較して成熟度はかなり高いものと考えられた.一方で,ジブチリルcAMPにより膵臓β細胞においてインスリンの分泌が亢進することは一般的に知られており,分泌されたインスリン自体がさらなる分化の促進に寄与することが想像できた.そこで,培養11日目から培養17日目にかけて培地に含まれるインスリンの濃度を変化させる実験を行った.通常の培養では培地に10 nMのインスリンが含まれるが,16 nMのインスリンがもっとも分化の効率が高く,それ以上の濃度では濃度に依存的に分化が抑制される傾向にあった.

5.ES細胞に由来するインスリン産生細胞の移植は糖尿病モデルマウスの血糖値を低下させる


 ES細胞から分化を誘導した膵臓β細胞が生体において機能するのかどうか調べるため,糖尿病モデルマウスであるAKITAマウスへと移植した.テトラベナジンおよびcAMPにより分化を誘導した細胞を腎臓の被膜の下へ移植したところ,血糖値は移植の直後からしだいに低下し,2週間のちには正常の範囲にもどった.移植ののち6週間まで血糖値を追跡したところ,血糖値にはさらに改善がみられた.また,移植する細胞が多いほど血糖値の降下は速かった.一方で,これら低分子化合物を用いずに分化させたときにも,分化した細胞を移植することによりゆっくりではあったが血糖値の改善効果がみられた.この結果は,今回の分化培養系では,未熟な膵臓β細胞,あるいは,分化の途上で細胞系譜として膵臓β細胞へとむかっている細胞が,in vitroにおける培養をおえた時点で多く含まれていることを示唆した.それらの細胞は生体において分化および成熟することにより血糖値を改善したものと想定された.

おわりに


 小胞モノアミン輸送体であるVMAT2に関するこれまでの研究は,おもにニューロンを用いて進められてきた.ニューロン終末における神経伝達物質としてモノアミンが使用されていることは一般的に知られているのに対し,膵臓においてモノアミンのはたす役割にはいまだ不明な点が多く,これにかかわるVMAT2の機能に関しては同じく知られていなかった.筆者らは,この研究をとおし,VMAT2がモノアミンを介し膵臓において内分泌細胞の分化を制御していることを新たに見い出した(図1).先行研究ではモノアミンのうちドーパミンやヒスタミンがインスリンの産生や分泌を阻害することが知れられている3).これに対し,モノアミンのうちセロトニンは妊娠期において膵臓β細胞の複製やグルコース応答性を制御する機能のあることが報告されている4).しかし,発生期におけるモノアミンの役割に関してこれまでよくわかっていなかった.今回の実験では,複数あるモノアミンのなかでもドーパミンの含量がもっとも大きな値を示していたが,すべてのモノアミンが膵臓β細胞への分化に対し抑制的にかかわっているという結果も得られたことから,生体においてモノアミンによるシグナル伝達は複雑な分子機構により膵臓の分化を制御していることが考えられ,今後,これらを詳細に解析していく必要がある.



 また,ES細胞に由来する多くのインスリン陽性細胞は複数の内分泌ホルモンを同時に発現していた.しかし,糖尿病モデルマウスへの移植したのちの組織片を解析したところ,インスリンのみに陽性を示す細胞が多く観察された.この移植前と移植後の細胞の変化については不明であるが,移植ののち2週間から急激に血糖値が低下したことから考えると,生体において膵臓β細胞の成熟が急速に進んだことが推察された.マウスの発生の初期にはインスリン陽性かつグルカゴン陽性を示す細胞が“first transition”の時期に一時的に現われるが,この細胞は最終的には成熟した膵臓β細胞にはならず発生の過程において失われる5).これらの細胞は膵臓β細胞が発現する成熟化マーカーを発現しない.これに対し,膵臓α細胞から膵臓β細胞への分化転換が起こるときにもインスリン陽性かつグルカゴン陽性を示す細胞のみられることが報告されているが,この細胞は成熟化マーカーを発現するので6),今回,分化の誘導された細胞は分化転換のときにみられる細胞に近いのかもしれない.このように,細胞が直接に分化転換してしまう現象は,最近になり報告されている,ヒトのES細胞に由来するインスリン産生細胞の移植の場合にもみられるようである.ヒトのES細胞の場合は,今回の研究と同じく複数のホルモンを産生するインスリン産生細胞ができるのだが,マウスへ移植するとすべてのインスリン産生細胞はインスリン産生能を失いグルカゴン陽性の膵臓α細胞へと変わってしまう2).このようなポリホルモン産生細胞の正体について,種の違いによるものなのか,あるいは,分化方法の違いによるものなのかは不明である.
 これまでに述べてきたように,この研究では,膵臓の分化,とくに内分泌前駆細胞への分化の誘導の過程において小胞モノアミン輸送体のひとつVMAT2による抑制作用のあることを発見した.また,cAMPが膵臓β細胞の成熟を促進し,VMAT2の阻害と相乗的に分化を促進することもわかった.糖尿病モデルマウスを用いた移植実験が一定の効果を示したことからも,これらの知見をもとに,ヒトのiPS細胞を用いた移植治療にむけ研究の進むことが期待される.

文 献



  1. Seino, S., Shibasaki, T. & Minami, K.: Dynamics of insulin secretion and the clinical implications for obesity and diabetes. J. Clin. Invest., 121, 2118-2125 (2011)[PubMed]

  2. Kelly, O. G., Chan, M. Y., Martinson, L. A. et al.: Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat. Biotechnol., 29, 750-756 (2011)[PubMed]

  3. Fulop, A. K., Foldes, A., Buzas, E. et al.: Hyperleptinemia, visceral adiposity, and decreased glucose tolerance in mice with a targeted disruption of the histidine decarboxylase gene. Endocrinology, 144, 4306-4314 (2003)[PubMed]

  4. Harris, P. E., Ferrara, C., Barba, P. et al.: VMAT2 gene expression and function as it applies to imaging β-cell mass. J. Mol. Med., 86, 5-16 (2008)[PubMed]

  5. Herrera, P. L.: Adult insulin- and glucagon-producing cells differentiate from two independent cell lineages. Development, 127, 2317-2322 (2000)[PubMed]

  6. Thorel, F., Nepote, V., Avril, I. et al.: Conversion of adult pancreatic α-cells to β-cells after extreme β-cell loss. Nature, 464, 1149-1154 (2010)[PubMed]



生命科学の教科書における関連するセクションへのリンク


東京大学 大学院総合文化研究科・教養学部附属教養教育高度化機構自然科学教育高度化部門から公開されている生命科学の教科書 “A Comprehensive Approach To LIFE SCIENCE”(羊土社『理系総合のための生命科学 第2版』の英語版)における関連するセクションへのリンクです.



著者プロフィール


坂野 大介(Daisuke Sakano)
略歴:2003年 京都工芸繊維大学大学院工芸科学研究科 修了,九州大学大学院農学研究院 博士研究員,米国Florida州立大学 博士研究員,2009年 熊本大学発生医学研究所 博士研究員を経て,同 特任助教(現 助教).
研究テーマ:膵臓β細胞の分化および成熟の制御機構.

粂 昭苑(Shoen Kume)
熊本大学発生医学研究所 教授.
研究室URL:http://www.imeg.kumamoto-u.ac.jp/divisions/stem_cell_biology

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