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バソプレッシン受容体V1aおよびV1bを欠損したマウスは時差症状を示さない

山口賀章・鈴木 暢・岡村 均
(京都大学大学院薬学研究科 システムバイオロジー分野)
email:山口賀章鈴木 暢岡村 均
DOI: 10.7875/first.author.2013.130

Mice genetically deficient in vasopressin V1a and V1b receptors are resistant to jet lag.
Yoshiaki Yamaguchi, Toru Suzuki, Yasutaka Mizoro, Hiroshi Kori, Kazuki Okada, Yulin Chen, Jean-Michel Fustin, Fumiyoshi Yamazaki, Naoki Mizuguchi, Jing Zhang, Xin Dong, Gozoh Tsujimoto, Yasushi Okuno, Masao Doi, Hitoshi Okamura
Science, 342, 85-90 (2013)




要 約


 時差症状は内在性の概日時計と外界の環境時計とのズレにより生じる.筆者らは,バソプレッシンの受容体であるV1aおよびV1bのダブルノックアウトマウスでは,明暗サイクルを前進あるいは後退させたときにも行動や時計遺伝子の発現,体温の変動の概日リズムは迅速に再同調し時差症状を示さないことを見い出した.興味深いことに,V1a V1bダブルノックアウトマウスの概日時計は通常の飼育環境においては正常な機能をもっていた.視交叉上核の切片培養を用いた検討から,野生型マウスの視交叉上核はV1aおよびV1bを介しニューロンのあいだに連絡をもつため,外界からの概日リズムの撹乱に対し抵抗性をもつと考えられた.野生型マウスにおいて視交叉上核のV1aおよびV1bのシグナルを薬理学的に阻害すると時差症状は改善された.したがって,バソプレッシンのシグナルに対する薬剤は時差やシフトワークによる概日リズムのズレに対する治療薬として期待される.

はじめに


 生体には内在性の概日時計があり,多くの生理機能や活動は約24時間を周期として変動する.これを概日リズムといい,地球上のほとんどの生物に存在する.とはいえ,ふだん概日時計は外界の明暗サイクルに完全に同調しているため,体内にこの時刻を発振するシステムのあることはあまり自覚されない.しかしながら,複数の時間帯を通る東西方向への海外旅行のとき,多くの旅行者は不眠や胃腸障害など,いわゆる時差ボケに悩まされることが多い.また,慢性的に時差環境におかれるキャビンアテンダントや交替制勤務者においては,心血管の異常や代謝障害といった生活習慣病のリスクが増大していることが知られている1).このように,時差症状は時間生物学のみならず社会的にも非常に注目されているにもかかわらず,その分子機構および細胞機構は不明である.
 哺乳類において概日時計の中枢は脳の視床下部に存在する視交叉上核(suprachiasmatic nucleus:SCN)である.視交叉上核から出力された時刻の情報は,全身に存在する末梢の時計を同期させている.それゆえ,時差環境においては,視交叉上核からの時刻の情報と外界からの時刻の情報(たとえば,明暗や温度のサイクル)とのあいだにズレが生じる.そこで,視交叉上核に時差症状の原因タンパク質があると考え,視交叉上核に特異的に発現する遺伝子において行動リズムの異常を検出するプログラムであるSCN Gene-Projectに2),時差実験をくわえたスクリーニングを行った.具体的には,免疫組織化学法により視交叉上核において発現リズムをもつ遺伝子を同定し,それらの遺伝子につき個々に遺伝子改変マウスを作製して時差環境における行動リズムを測定する,というものである.このスクリーニングの結果,バソプレッシンとその受容体であるV1aおよびV1bが時差症状に関連するタンパク質の候補としてあがってきた.これらの発現は視交叉上核において概日リズムを示すことは知られていたものの,概日時計における機能は不明であった3)

1.V1a V1bダブルノックアウトマウスの作製と時差環境における行動の観察


 V1aおよびV1bのダブルノックアウトマウスを作製し,時差環境における行動を観察した.マウスを約200ルクスの明暗環境が制御された飼育箱において自由飲水条件にて個別に飼育し,赤外線センサーあるいは輪回しにより行動を記録した.マウスを明期12時間暗期12時間の明暗サイクルで飼育すると,マウスは夜行性なので野生型マウスとV1a V1bダブルノックアウトマウスはともに暗期に強い行動を示した.2週間にわたり観察したのち,明暗サイクルを8時間前進させた.これは,日本から米国西部への移動を模倣する時差実験である.野生型マウスでは時差をあたえたのち行動リズムは少しずつ前進し,約10日後には新しい明暗環境に順応した.一方で,V1a V1bダブルノックアウトマウスは時差をあたえるとすぐに順応した.順応のスピードを定量的に比較するため行動の位相が50%変動するのに要する日数であるPS50という指標を用いると,V1a V1bダブルノックアウトマウスは野生型マウスよりも時差に対し迅速に再同調することを確認できた.つづいて,明暗サイクルを8時間後退させるという,日本からヨーロッパへの移動を模倣した時差実験を行ったところ,野生型マウスは5~6日で再同調したが,V1a V1bダブルノックアウトマウスは1日で再同調した.また,PS50についても,V1a V1bダブルノックアウトマウスは野生型マウスよりずっと小さかった.V1aとV1bのどちらが時差をあたえたのちの再同調に関与しているのか,それぞれのシングルノックアウトマウスの行動を観察したところ,ともに,野生型マウスより早く,V1a V1bダブルノックアウトマウスより遅く,再同調した.したがって,V1aとV1bのどちらも時差をあたえたのちの再同調に関与していることがわかった.
 時差環境におけるV1a V1bダブルノックアウトマウスの行動はたんに環境の明暗のみにより決定されているという可能性を排除するため,時差をあたえたのちマウスを2週間にわたり恒暗条件におき,行動リズムの位相がどれだけ前進するか測定した.明暗サイクルを1日だけ前進させてから恒暗条件においた場合でも,V1a V1bダブルノックアウトマウスは野生型マウスと比べ,より大きく行動リズムの位相が前進した.また,明暗サイクルを1日だけ後退させた場合でも,V1a V1bダブルノックアウトマウスは野生型マウスと比べ,行動リズムの位相のより大きな後退を示した.したがって,V1a V1bダブルノックアウトマウスが時差をあたえたのちすぐに再同調したのは,内在性の概日時計の位相が迅速に変動したものと考えられた.
 では,どのような分子機構により時差に対する順応の速さは変動したのだろうか.V1a V1bダブルノックアウトマウスにおいて通常の状態での概日時計の状態について調べたところ,恒暗条件における行動リズムの周期や,代表的な時計遺伝子であるPer1遺伝子,Per2遺伝子,Bmal1遺伝子,Dbp遺伝子の視交叉上核における発現リズムは,すべて正常であった.また,主観的夜における光パルス刺激による行動リズムの位相の後退量やPer1遺伝子の発現量において,V1a V1bダブルノックアウトマウスと野生型マウスとのあいだに有意な差はなかった.すなわち,V1a V1bダブルノックアウトマウスにおいて,概日リズムの発振や光に対する反応性は正常であった.このことは,V1a V1bダブルノックアウトマウスの時差をあたえたのちの迅速な再同調は,概日時計に障害があるためではないことを示していた.V1a V1bダブルノックアウトマウスは200ルクスという強い光に対しなんらかの病的な反応を起こしたのだろうか? 約50ルクスという中間的な明るさの照明のもと時差実験を行ったが,その場合でも,V1a V1bダブルノックアウトマウスは明暗サイクルの前進あるいは後退に対し迅速に再同調した.したがって,V1a V1bダブルノックアウトマウスの時差への順応は環境の光の強さにはよらないといえた.

2.時差環境における時計遺伝子の発現プロファイル


 時差に順応していく過程を検討するため,時差環境におかれた視交叉上核において4つの時計遺伝子,Per1遺伝子,Per2遺伝子,Bmal1遺伝子,Dbp遺伝子の発現の変動を測定した.時差をあたえるまえ1日半,時差をあたえたのち野生型マウスは10日間,V1a V1bダブルノックアウトマウスは6日間にわたり,4時間ごとにレーザーミクロダイセクション法により視交叉上核を単離した.時差をあたえるまえは,野生型マウスとV1a V1bダブルノックアウトマウスの両方において,Per1遺伝子,Per2遺伝子,Dbp遺伝子は明期に,Bmal1遺伝子は暗期にピークをもつ明瞭な概日リズムを示した.しかしながら,時差をあたえたのちの野生型マウスとV1a V1bダブルノックアウトマウスとの時計遺伝子の概日振動のパターンは大きな違いを生じた.野生型マウスではPer1遺伝子およびPer2遺伝子は時差をあたえたのち1~2日は概日リズムを消失し,3~7日にかけて振動はするもののその振幅は小さく,8日目になりようやくもとのパターンに回復した.Bmal1遺伝子およびDbp遺伝子も時差をあたえたのち1~5日は著しく概日リズムが乱れており,完全に回復するには8~9日を要した.一方で,V1a V1bダブルノックアウトマウスにおいては時差をあたえたのち1~2日には一部に振動の乱れが観察されたものの,3日目には4つの時計遺伝子はすべて振動のピークの時間や振幅が回復した.また,ジゴキシゲニンin situハイブリダイゼーション法により細胞のレベルで時計遺伝子の発現を検討したところ,野生型マウスの視交叉上核ではV1a V1bダブルノックアウトマウスとは異なり,Per1遺伝子およびDbp遺伝子のロバストな概日振動は時差をあたえたのち3日目では観察されなかった.
 時差環境におかれた末梢の臓器における時計遺伝子の発現リズムを測定した.視交叉上核における結果とは異なり,肝臓における時計遺伝子の概日振動は時差をあたえたのちの再同調の期間においても維持されていた.しかしながら,振動のピークの時間は大きな影響をうけていた.ピークの位相が回復するには野生型マウスでは9~10日間を要したが,V1a V1bダブルノックアウトマウスにおいては5日間であった.同様の結果は腎臓においても得られた.また,時差環境における体温の概日リズムを継時的に測定したところ,野生型マウスでは10日後に再同調したのに対し,V1a V1bダブルノックアウトマウスでは5日後に再同調した.
 以上の結果をまとめると,明暗サイクルを前進させたとき,V1a V1bダブルノックアウトマウスにおいては検討したすべての時計遺伝子の発現は野生型マウスのものより迅速に再同調した.また,野生型マウスとV1a V1bダブルノックアウトマウスのどちらにおいても,時差をあたえたのち,まず中枢である視交叉上核における時計遺伝子の概日リズムが回復し,1~2日後に末梢の時計遺伝子あるいは体温の概日リズムが回復したことから,視交叉上核の概日時計が時差をあたえたのちの全身における回復の期間を決定していると考えられた.

3.視交叉上核におけるバソプレッシンのシグナルおよびニューロンのあいだの連絡


 バソプレッシンを発現するニューロンが視交叉上核において主要な細胞集団を形成していること,また,バソプレッシンの合成および視交叉上核から脳脊髄液への放出に明瞭な概日リズムのみられることはよく知られている4).バソプレッシン発現ニューロンはシナプス結合を介して連絡し,視交叉上核において局所的な神経回路を形成している5).バソプレッシンの受容体であるV1aとV1bも視交叉上核のニューロンにおいて発現していることが知られていたが,二重in situハイブリダイゼーション法により視交叉上核の背内側部においてバソプレッシン発現ニューロンがV1aも発現していることが確認された.また,バソプレッシンとV1aは,それぞれが逆の位相をとり安定した概日振動を示していたことから,このバソプレッシン発現ニューロンによる局所的な神経回路は概日時計において機能をもつと考えられた.そこで,時差環境におかれた野生型マウスの視交叉上核において観察された時計遺伝子の発現の概日振動の消失は,視交叉上核におけるバソプレッシンを介したニューロンのあいだの連絡の変化が原因ではないかとの仮説をたてた.
 Per1遺伝子プロモーターのもとルシフェラーゼを発現するトランスジェニックマウスから取り出した視交叉上核の切片培養において生物発光をリアルタイムでモニターすることにより,視交叉上核に存在する何百というニューロンの概日リズムを同時に測定することが可能である6).この系を利用して,バソプレッシンのシグナルが視交叉上核のニューロンが示す概日リズムにどのように影響を及ぼすかについて検討した.野生型マウスもV1a V1bダブルノックアウトマウスもともに,視交叉上核のニューロンは背内側側から腹外側側へと時空間的に組織された概日振動のパターンを示した.このようなすべてのニューロンからなる秩序だった位相の順序は,シクロヘキシミドを投与することによりリセットできる6).そのあとシクロヘキシミドを除去すると,野生型マウスの視交叉上核ではニューロンのあいだにもともとあった位相の順序のとおりに個々のニューロンの概日振動は回復したが,V1a V1bダブルノックアウトマウスではその順序は大きく変化した.したがって,V1a V1bダブルノックアウトマウスの視交叉上核は野生型マウスより外界からの撹乱の影響をうけやすいと考えられた.このニューロンのあいだの連絡の脆弱性のため,V1a V1bダブルノックアウトマウスは時差に対し迅速に順応できると考えられた.
 数理モデルにより時差環境におけるバソプレッシンを介した視交叉上核のニューロンのあいだの連絡の効果について検討した.この数理モデルは,視交叉上核にて3つの振動子,末梢にて1つの振動子をもつ位相振動子モデルにもとづき,連絡した複数の振動子のダイナミクスを理解するのに有用なものである.この数理モデルにおいても,明暗サイクルの前進ののち,野生型の視交叉上核からの出力は数日間にわたり概日リズムを消失したが,V1aおよびV1bをともに欠損した視交叉上核からの出力は迅速に概日リズムを回復した.また,末梢からの出力についても,V1aおよびV1bをともに欠損した場合には迅速に概日リズムを回復することが再現された.

4.V1aおよびV1bのシグナルの薬理学的な阻害


 この数理モデルによると,バソプレッシンを介したニューロンのあいだの連絡が弱くなればなるほど,再同調に要する日数が短くなった.そこで,V1aのアンタゴニストであるOPC-21268とV1bのアンタゴニストのであるSSR 149415の混合物を,野生型マウスの視交叉上核に浸透圧ポンプにより持続的に投与し,時差環境における行動を観察したところ,アンタゴニストの濃度に依存して再同調に要する時間は有意に短くなった.つづいて,野生型の視交叉上核の切片培養を用いて,視交叉上核のニューロンのあいだに時空間的に組織された概日振動のパターンに対するこれらのアンタゴニストの作用について検討した.シクロヘキシミドを投与して位相の順序をリセットしたのちアンタゴニストを投与すると,V1a V1bダブルノックアウトマウスの視交叉上核において観察されたように,個々のニューロンの概日振動はもとの順序のとおりに回復しなかった.したがって,視交叉上核におけるV1aおよびV1bのシグナルが時差をあたえたのちの再同調に要する時間を決定する重要な役割を担っていることがわかった.また,V1a V1bダブルノックアウトマウスが時差に対し迅速に再同調するのは,このマウスにおける時差への再同調はたんにニューロンの発達不全によるのではないこともいうことができた.

おわりに


 この研究において,時差環境における行動や時計遺伝子の発現,体温の変動の概日リズムを測定することにより,バソプレッシンの受容体であるV1aおよびV1bをともに欠損したマウスは時差症状を示さないことが見い出された.バソプレッシンやその受容体と同様に,血管作動性腸管ペプチドとその受容体であるVPAC2もまた視交叉上核において発現していることが知られており,その概日時計における機能が探索されている7).VPAC2ノックアウトマウスには行動や神経活動あるいは時計遺伝子の発現の概日リズムに大きな障害がみられる8).対照的に,V1a V1bダブルノックアウトマウスは慣例的な明暗条件や恒暗条件においては行動や時計遺伝子の発現の概日リズムには異常を認めない.しかし,このマウスは時差環境においてのみ,行動や時計遺伝子の発現あるいは体温の変動の概日リズムが迅速に再同調するという特徴をもつ.バソプレッシンのシグナルにより正常なニューロンのあいだに連絡があると,視交叉上核はもとの概日振動を維持できるために時差のような外界からの撹乱に対し抵抗性を示すが(したがって,野生型マウスでは時差をあたえたのちの再同調に時間がかかる),この抵抗性がV1a V1bダブルノックアウトマウスでは脆弱になっているため時差に対し迅速に再同調すると考えられた(図1).



 疫学的な研究により,慢性的に時差環境におかれた交替制勤務者では高血圧や肥満あるいは糖尿病といった生活習慣病のリスクが増大していることがわかった.この研究から,交替制勤務者の概日リズムの不調和を改善するのに,バソプレッシンのシグナルが有望な治療標的であると考えられた.

文 献



  1. Pan, A., Schernhammer, E. S., Sun, Q. et al.: Rotating night shift work and risk of type 2 diabetes: two prospective cohort studies in women. PLoS Med., 8, e1001141 (2011)[PubMed]

  2. Okamura, H.: Suprachiasmatic nucleus clock time in the mammalian circadian system. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol., 72, 551-556 (2007)[PubMed]

  3. Kallo, I., Kalamatianos, T., Piggins, H. D. et al.: Ageing and the diurnal expression of mRNAs for vasoactive intestinal peptide and for the VPAC2 and PAC1 receptors in the suprachiasmatic nucleus of male rats. J. Neuroendocrinol., 16, 758-766 (2004)[PubMed]

  4. Schwartz, W. J. & Reppert, S. M.: Neural regulation of the circadian vasopressin rhythm in cerebrospinal fluid: a pre-eminent role for the suprachiasmatic nuclei. J. Neurosci., 5, 2771-2778 (1985)[PubMed]

  5. Castel, M., Feinstein, N., Cohen, S. et al.: Vasopressinergic innervation of the mouse suprachiasmatic nucleus: an immuno-electron microscopic analysis. J. Comp. Neurol., 298, 172-187 (1990)[PubMed]

  6. Yamaguchi, S., Isejima, H., Matsuo, T. et al.: Synchronization of cellular clocks in the suprachiasmatic nucleus. Science, 302, 1408-1412 (2003)[PubMed]

  7. Colwell, C. S., Michel, S., Itri, J. et al.: Disrupted circadian rhythms in VIP- and PHI-deficient mice. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol., 285, R939-R949 (2003)[PubMed]

  8. Harmar, A. J., Marston, H. M., Shen, S. et al.: The VPAC2 receptor is essential for circadian function in the mouse suprachiasmatic nuclei. Cell, 109, 497-508 (2002)[PubMed]



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東京大学 大学院総合文化研究科・教養学部附属教養教育高度化機構自然科学教育高度化部門から公開されている生命科学の教科書 “A Comprehensive Approach To LIFE SCIENCE”(羊土社『理系総合のための生命科学 第2版』の英語版)における関連するセクションへのリンクです.



著者プロフィール


山口 賀章(Yoshiaki Yamaguchi)
略歴:2004年 京都大学大学院生命科学研究科 修了,同年 米国Salk Institute for Biological Studies博士研究員を経て,2007年より京都大学大学院薬学研究科 助教.
研究テーマ:哺乳類の視交叉上核の概日時計における機能.
関心事:農業政策.

鈴木 暢(Toru Suzuki)
京都大学大学院薬学研究科 在学中.

岡村 均(Hitoshi Okamura)
京都大学大学院薬学研究科 教授.
研究室URL:http://www.pharm.kyoto-u.ac.jp/system-biology/

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