繁冨英治・Xiaoping Tong・Baljit S. Khakh
（米国California大学Los Angeles校David Geffen School of Medicine，Department of Physiology）
email：繁冨英治
DOI: 10.7875/first.author.2012.005

要 約

　脳のグリア細胞の一種であるアストロサイトはシナプス形成の制御やシナプス機能の維持などの役割を担っている．アストロサイトは電気的に非興奮性であるが，細胞内Ca²⁺濃度をダイナミックに変化させることにより“Ca²⁺興奮”を起こすことが知られている．これまでの研究の多くは，細胞内Ca²⁺ストアからのCa²⁺放出を介したCa²⁺濃度の変化とその機能的な役割に焦点をあててきた．近年，筆者らは，新規の膜移行型Ca²⁺感受性蛍光タンパク質を開発し，海馬培養アストロサイトの細胞膜の近傍で自発的に起こるマイクロドメイン様の局所的なCa²⁺シグナルの存在をはじめて明らかにした．今回の研究において，薬理学的な解析および遺伝学的な解析の結果はこの局所的なCa²⁺シグナルはTRPA1チャネルを介したCa²⁺流入によることを示した．さらに，TRPA1チャネルを介し流入したCa²⁺は細胞質に拡散することで静止時の細胞質でのCa²⁺濃度を調節し，アストロサイトの細胞膜に存在するGABAトランスポーターの機能を制御することにより細胞外のGABAレベルを調節し，その結果，抑制性シナプス伝達を制御していることが示された．

はじめに

　中枢神経系のグリア細胞の一種であるアストロサイトは，ニューロンの構造的な支持，ニューロンへの栄養の供給，神経活動にともない放出された伝達物質やイオンの除去など，ニューロンを保護しその活動を助ける役割を担う，いわゆる“ハウスキーピング細胞”として考えられてきた．アストロサイトは活動電位を発生しないが神経伝達物質を感受する受容体の活性化を介して，細胞内Ca²⁺ストアからのCa²⁺放出を介し細胞内Ca²⁺濃度を上昇させる，いわゆる“Ca²⁺興奮”を起こす．近年，アストロサイトが細胞内Ca²⁺濃度に応じニューロンに作用する物質（グリア伝達物質）を放出することが報告され¹⁾，ニューロンとアストロサイトとが双方向的にシグナル伝達物質を放出することで互いを制御しあっている可能性が提唱されている²⁾．しかし，生理的な条件におけるCa²⁺濃度に依存的なグリア伝達物質の放出に疑問を呈する報告もあり³⁾，アストロサイトにおけるCa²⁺シグナルの生理学的な意義はいまだ明らかではない⁴⁾．この問題が未解決である原因のひとつに，従来の方法ではアストロサイトの細胞内の局所におけるCa²⁺濃度の変化の測定は困難なことがあげられる⁵⁾．アストロサイトは微細突起を介しシナプスと直接に接触する．この微細突起における局所的なCa²⁺シグナルの理解は，アストロサイトがニューロンの興奮に対しどう応答し，それに応じどのようにニューロンにシグナルを伝達するかという，ニューロンとの機能の連関を理解するうえで必須である．近年，筆者らは，微細突起におけるCa²⁺濃度の変化を効率的かつ鋭敏に検出する新規のCa²⁺感受性蛍光タンパク質Lck-GCaMP2 ⁶⁾ およびLck-GCaMP3 ⁷⁾ を開発した．今回は，このLck-GCaMP3を用いて観察されたアストロサイトの細胞膜の近傍における局所的なCa²⁺の動態に着目し，その詳細な解析からTRPA1チャネルを介したCa²⁺流入の存在をはじめて明らかにし，さらに，このTRPA1チャネルによるCa²⁺流入の生理学的な役割のひとつを明らかにした．

1．膜移行型Ca²⁺感受性蛍光タンパク質は海馬培養アストロサイトにおける新規のCa²⁺シグナルを明らかにした

　細胞膜の近傍におけるCa²⁺濃度の変化を測定するため，Ca²⁺感受性蛍光タンパク質GCaMP3のN末端に膜移行シグナルLckを融合した膜移行型Ca²⁺感受性蛍光タンパク質Lck-GCaMP3を海馬培養アストロサイト（ニューロンとの共培養）に発現させたところ，静止時に細胞膜において局所的に発生するCa²⁺濃度の変化が観察された．この局所的なCa²⁺シグナルは半値全幅が5μm程度であり，細胞膜のさまざまな箇所でランダムに，また，同じ箇所で頻回に発生した．この局所的なCa²⁺シグナルをspotty Ca²⁺シグナルと名づけた．spotty Ca²⁺シグナルの頻度およびその大きさはニューロン活動の抑制および神経伝達物質であるグルタミン酸あるいはATPの受容体の遮断薬に影響されなかったことから，アストロサイトに内因性の機構を介し発生するものと考えられた．spotty Ca²⁺シグナルは細胞外のCa²⁺の除去により消失し細胞内Ca²⁺ストアの枯渇の影響をうけなかったことから，細胞外からのCa²⁺流入により生じるものと解釈された．

2．局所的なCa²⁺シグナルはTRPA1チャネルを介していた

　spotty Ca²⁺シグナルはTRPチャネルの非選択的な遮断薬により消失したことから，TRPチャネルの開口により惹起されるものと考えられた．薬理学的な特性の解析および遺伝子ノックダウン法による解析を行ったところ，TRPチャネルのうちTRPA1チャネルの遮断薬であるHC-030031によりspotty Ca²⁺シグナルは可逆的に消失し，siRNAによるTrpa1遺伝子のノックダウンによりspotty Ca²⁺シグナルを生じる細胞数は減少した．さらに，低濃度のTRPA1チャネルのアゴニストの投与およびTRPA1チャネルの強制発現によりアストロサイトにおけるspotty Ca²⁺シグナルの発生数は増加し，HEK293細胞へのTRPA1チャネルの強制発現によりspotty Ca²⁺シグナルと類似した局所的なCa²⁺シグナルが惹起されたことから，spotty Ca²⁺シグナルはTRPA1チャネルの開口により発生しているものと考えられた．近年に行われたアストロサイトのトランスクリプトーム解析ではTrpa1 mRNA発現レベルは検出限界以下ではあったが⁸⁾，ウェスタンブロッティング法によりTRPA1チャネルのおよそ130 kDのバンドが検出されたこと，TRPA1チャネルのアゴニストは外向きの整流性を示す電流を誘発したがこの電流はTrpa1遺伝子のノックダウンにより減弱したこと，さまざまなTRPA1チャネルのアゴニストはアストロサイトにおけるCa²⁺濃度を上昇させたこと（ニューロンでは，ほぼ影響なし），TRPA1チャネルのアゴニストによるCa²⁺濃度の上昇はTRPA1チャネル遮断薬およびTrpa1遺伝子ノックダウンによりほぼ完全に消失したことから，海馬培養アストロサイトにおけるTRPA1チャネルの発現が強く示唆された．TRPA1チャネルはCa²⁺透過性が非常に高く（およそ17％），ポアダイレーションによりさらに高いCa²⁺透過性を示し，細胞内においてCa²⁺自体がTRPA1チャネルを活性化できるなどの性質をもつことから⁹⁾，発現レベルが低くてもこの研究で検出できたようなCa²⁺シグナルを発生することが十分に可能であると考えられた．急性脳スライス標本における海馬放射状層アストロサイトはTRPA1チャネルのアゴニストによるCa²⁺濃度の上昇を示し，これはTRPA1チャネルの遮断薬により減弱した．以上の結果は，アストロサイトはin vitroおよびin situにおいてTRPA1チャネルを機能的に発現し，このTRPA1チャネルの開口を介しspotty Ca²⁺シグナルが発生しているものと解釈された．

3．TRPA1チャネルによるCa²⁺流入はアストロサイトの静止時の細胞質でのCa²⁺濃度を調節した

　HC-030031によるTRPA1チャネルの遮断は，Fluo-4あるいはFura-2により測定された海馬培養アストロサイトにおける細胞質の全体のCa²⁺濃度をおよそ120 nMから50 nMに低下させた．TRPA1チャネルの遮断によるCa²⁺濃度の低下はニューロンでは観察されなかった．TRPA1チャネルの遮断による全体的なCa²⁺濃度の低下はマウスおよびラットの急性脳スライス標本における海馬アストロサイトにおいても惹起され，TRPA1チャネルノックアウトマウスでは減弱した．以上の結果は，TRPA1チャネルを介した局所的なCa²⁺流入はマイクロドメイン様のCa²⁺シグナルを形成し，さらに，これが細胞質に拡散することにより静止時の細胞質でのCa²⁺濃度を調節していることを示唆した（図1）．

4．TRPA1チャネルの抑制はGABA作動性シナプス伝達を抑制した

　アストロサイトの細胞質でのCa²⁺濃度の変化が興奮性シナプスに及ぼす影響についてはこれまで多く報告されている．一方，抑制性シナプス伝達に及ぼす影響についての報告はあまりない．そこで，Ca²⁺の選択的なキレート剤であるBAPTAをホールセルパッチクランプ法により急性脳スライス標本における海馬放射状層アストロサイトに負荷してアストロサイトの細胞内Ca²⁺濃度を緩衝し，これがニューロンの抑制性シナプス伝達に及ぼす影響について検討した．BAPTAと同時に蛍光物質を負荷すると負荷したアストロサイトの周囲およそ60個の細胞から蛍光が観察された．これは，隣接するアストロサイトにギャップ結合を介し蛍光物質が拡散したためと考えられ，この方法により複数の細胞にBAPTAを同時に負荷することが可能であった．この実験条件においてBAPTAを負荷したアストロサイトの近傍100μm以内のニューロンへのGABAの入力をホールセルパッチクランプ法により検出したところ，錐体ニューロンでは影響がなかったのに対し，放射状層介在ニューロンにおいてはGABA作動性シナプス伝達の効率が低下した．BAPTAを用い緩衝液により細胞内Ca²⁺濃度をさまざまに変化させたところ，Ca²⁺濃度を静止時の濃度（およそ120 nM）から上昇させたときにはGABA作動性シナプス伝達は変化しなかったのに対し，Ca²⁺濃度を低下したときにはGABA作動性シナプス伝達は抑制された．BAPTAよりもCa²⁺との結合速度の遅いCa²⁺選択的キレート剤EGTAの負荷ではGABA作動性シナプス伝達の効率は低下しなかったことから，Ca²⁺は局所的に作用するものと解釈された．
　TRPA1チャネルの遮断薬であるHC-030031により介在ニューロンにおけるGABA作動性シナプス伝達の効率は低下した．一方，錐体ニューロンではHC-030031による影響はなかった．Ca²⁺選択的キレート剤BAPTAをアストロサイトに負荷したときにはHC-030031は作用しなかった．そのため，HC-030031はアストロサイトの細胞内Ca²⁺濃度を低下させることでその作用を発揮したものと考えられた．一方，TRPA1チャネルのアゴニストは抑制性シナプス伝達に影響しなかった．以上の結果は，アストロサイトにおけるTRPA1チャネルを介した自発的なCa²⁺流入の遮断は介在ニューロンにおけるGABA作動性シナプス伝達の効率を低下させるものと解釈された．さらに，TRPA1チャネルノックアウトマウスではBAPTAによるアストロサイトにおけるCa²⁺濃度の緩衝，および，TRPA1チャネルの遮断による抑制性シナプス伝達に及ぼす影響が観察されなかったことから，HC-030031はTRPA1チャネルに実際に作用していること，および，アストロサイトへのBAPTAの負荷の抑制性シナプス伝達に及ぼす影響はアストロサイトのTRPA1チャネルを介し流入したCa²⁺濃度を緩衝した結果であることが示された．

5．アストロサイトの細胞内においてCa²⁺はGABAトランスポーターの機能を制御していた

　Ca²⁺選択的キレート剤BAPTAによるアストロサイトにおけるCa²⁺濃度の緩衝は，細胞の周囲の存在するシナプスからもれ出したGABAにより起こる持続性のGABA_A電流の増大，GABAの局所的な投与に誘発される電流の減少，電気刺激に誘発されるGABA_A電流の減少をひき起こした．これらの結果から，アストロサイトへのBAPTAの負荷が細胞外のGABA濃度を上昇させ，これによりGABA_A受容体が脱感作したため，抑制性シナプス伝達は抑制されたと考えられた．それでは，どのようにして細胞外のGABA濃度は上昇したのであろうか？　細胞外のGABAはGABAトランスポーターにより細胞内に取り込まれることが知られており，GABAトランスポーターの機能障害は細胞外のGABA濃度の上昇をひき起こすものと考えられた．BAPTAの負荷によりGABAトランスポーターの機能が障害されるという仮説をたて，GABAトランスポーターを薬理学的に阻害することにより同様の抑制性シナプス伝達の効率の低下が観察されるかどうかを検討した．GABAトランスポーターは現在まで4種類が同定されており，そのうち，GAT-1およびGAT-3が海馬を含め脳に広範に発現していることが報告されている．GAT-1およびGAT-2の阻害薬は抑制性シナプス伝達に影響しなかったのに対し，GAT-3の選択的な阻害薬は抑制性シナプス伝達を抑制した．さらに，このGAT-3による抑制性シナプス伝達の抑制作用はアストロサイトへのBAPTAの負荷またはHC-030031の投与の条件では観察されなかった．以上の結果から，この抑制性シナプス伝達の抑制はアストロサイトにおけるTRPA1チャネルの遮断によりGABAトランスポーターGAT-3の機能が障害されたことによりひき起こされたと解釈された．GABAトランスポーターの機能が抑制される機構を検討したところ，アストロサイトへのBAPTAの負荷はGAT-3の発現量を減少させることが明らかになった．さらに，アストロサイトにおけるエンドサイトーシスの薬理学的な阻害はBAPTAの負荷による抑制性シナプス伝達の抑制作用を消失させ，GAT-3の発現量の減少を阻害した．これらの結果より，アストロサイトの細胞膜におけるGAT-3の量は細胞内Ca²⁺濃度に依存しており，エンドサイトーシスを介し制御されていることが示唆された（図2）．

おわりに

　今回の研究は，アストロサイトにおいてTRPA1チャネルを介したCa²⁺流入経路の存在をはじめて示し，GABAトランスポーターGAT-3を介した細胞外のGABAの取り込みというアストロサイトにおけるハウスキーピング機能のひとつが，このTRPA1チャネルを介し流入したCa²⁺により制御されていることを示した．GABAの取り込み能の障害によるGABA作動性シナプス伝達の効率の低下はアストロサイトの細胞内におけるCa²⁺濃度の低下により惹起されたが，細胞内でのCa²⁺濃度の上昇による影響はなかった．この結果から，静止時の細胞質におけるCa²⁺濃度においては細胞外のGABAを取り込み制御するうえで十分な量のGAT-3が存在しているものと考えられた．
　ここで紹介した新規のCa²⁺感受性蛍光タンパク質によりアストロサイトにおける局所的なCa²⁺シグナルについて詳細に検討することが可能になった．しかしながら，いまださまざまな疑問が残されている．TRPA1チャネルの開口はどのように制御されているのか？　それは，ニューロンやアストロサイトの産生するメディエーターを介し活性化されているのか？　TRPA1チャネルを介したCa²⁺シグナルは細胞外のGABAレベルの調節のみに必要なのか？　なぜ，介在ニューロンのみが特異的に制御されるのか？　海馬以外の脳部位でも同様のTRPA1チャネルを介したシナプスの制御はあるのか？　アストロサイトにおけるCa²⁺シグナルは完全に理解されているのか？　今後の研究により，細胞内Ca²⁺ストアからのCa²⁺放出経路にくわえ，今回の研究で示したような細胞膜を介したCa²⁺流入経路¹⁰⁾ を含めたアストロサイトにおけるCa²⁺シグナルの詳細についての理解が深まり，その生理学的な意義がさらに解明されることが期待される．

文 献

1. Henneberger, C., Papouin, T., Oliet, S. H. et al.: Long-term potentiation depends on release of D-serine from astrocytes. Nature, 463, 232-236 (2010)[PubMed]


2. Halassa, M. M. & Haydon, P. G.: Integrated brain circuits: astrocytic networks modulate neuronal activity and behavior. Annu. Rev. Physiol., 72, 335-355 (2010)[PubMed]


3. Agulhon, C., Fiacco, T. A. & McCarthy, K. D.: Hippocampal short- and long-term plasticity are not modulated by astrocyte Ca²⁺ signaling. Science, 327, 1250-1254 (2010)[PubMed]


4. Hamilton, N. B. & Attwell, D.: Do astrocytes really exocytose neurotransmitters? Nat. Rev. Neurosci., 11, 227-238 (2010)[PubMed]


5. Reeves, A. M., Shigetomi, E. & Khakh, B. S.: Bulk loading of calcium indicator dyes to study astrocyte physiology: key limitations and improvements using morphological maps. J. Neurosci., 31, 9353-9358 (2011)[PubMed]


6. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V. et al.: A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci., 13, 759-766 (2010)[PubMed]


7. Shigetomi, E., Kracun, S. & Khakh, B. S.: Monitoring astrocyte calcium microdomains with improved membrane targeted GCaMP reporters. Neuron Glia Biol., 6, 183-191 (2010)[PubMed]


8. Cahoy, J. D., Emery, B., Kaushal, A. et al.: A transcriptome database for astrocytes, neurons, and oligodendrocytes: a new resource for understanding brain development and function. J. Neurosci., 28, 264-278 (2008)[PubMed]


9. Nilius, B., Prenen, J. & Owsianik, G.: Irritating channels: the case of TRPA1. J. Physiol., 589, 1543-1549 (2011)[PubMed]


10. Golovina, V. A.: Visualization of localized store-operated calcium entry in mouse astrocytes. Close proximity to the endoplasmic reticulum. J. Physiol., 564, 737-749 (2005)[PubMed]

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