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骨髄異形成症候群におけるRNAスプライシング経路の変異

小川 誠司
(東京大学医学部附属病院 キャンサーボード)
email:小川誠司
DOI: 10.7875/first.author.2011.157

Frequent pathway mutations of splicing machinery in myelodysplasia.
Kenichi Yoshida, Masashi Sanada, Yuichi Shiraishi, Daniel Nowak, Yasunobu Nagata, Ryo Yamamoto, Yusuke Sato, Aiko Sato-Otsubo, Ayana Kon, Masao Nagasaki, George Chalkidis, Yutaka Suzuki, Masashi Shiosaka, Ryoichiro Kawahata, Tomoyuki Yamaguchi, Makoto Otsu, Naoshi Obara, Mamiko Sakata-Yanagimoto, Ken Ishiyama, Hiraku Mori, Florian Nolte, Wolf-Karsten Hofmann, Shuichi Miyawaki, Sumio Sugano, Claudia Haferlach, H. Phillip Koeffler, Lee-Yung Shih, Torsten Haferlach, Shigeru Chiba, Hiromitsu Nakauchi, Satoru Miyano, Seishi Ogawa
Nature, 478, 64-69 (2011)




要 約


 骨髄異形性症候群は造血前駆細胞に由来する腫瘍性の疾患で,形態の異常をともなう血球産生の異常と急性骨髄性白血病への進行を特徴とする難治性の造血器腫瘍である.その分子病態については,近年,ゲノム解析によりエピジェネティックな制御にかかわる遺伝子変異が同定されてその理解が進んだが,これらの多くはほかの骨髄系の腫瘍においても同様に変異が認められることから骨髄異形性症候群を特徴づける遺伝学的な背景については不明であった.今回,筆者らは,29例の骨髄異形性症候群および関連疾患について次世代シークエンサーを用いたエキソーム解析を行うことにより,RNAスプライシング経路にかかわるタンパク質が高頻度に変異を生じていることを見い出した.

はじめに


 骨髄異形成症候群とこれに関連する疾患(慢性骨髄単球性白血病および骨髄異形性症候群に由来する白血病などを含む)は造血前駆細胞に由来する骨髄系の腫瘍で,形態異常をともなう血球産生の異常(貧血や白血球および血小板の低下)と急性骨髄性白血病への移行を特徴とする難治性の造血器腫瘍のひとつである.1990年代に疾患に特異的な染色体転座の解析からその分子病態の理解が進んだ急性骨髄性白血病とは対照的に,これまで骨髄異形性症候群の分子病態の解明に大きな進展は認められていなかったが,近年,一連のゲノム解析をつうじその病態が明らかにされつつある1).すなわち,骨髄異形性症候群においてクロマチン修飾にかかわるASXL1EZH2,また,DNAメチル化の制御にかかわるTET2IDH1IDH2DNMT3Aなどのエピジェネティックな制御にたずさわるタンパク質が遺伝子変異により高頻度に異常をきたしていることが示されたことから,これらによるエピジェネティックな制御の異常が骨髄異形性症候群の発症にかかわっていることが強く示唆されている.しかし,これらの遺伝子変異は急性骨髄性白血病など骨髄系の腫瘍でもしばしば認められることから,骨髄異形性症候群の病態はその肝心な点,すなわち,急性骨髄性白血病など骨髄系の腫瘍と分子病態においてどのように区別されるかという点でなお多くが不明であるといわざるをえない.そこで,筆者らは,骨髄異形性症候群の分子病態を特徴づける遺伝子変異を明らかにする目的で,29例の骨髄異形性症候群および関連疾患について次世代シークエンサーを用いた全エキソン解析(エキソーム解析)を行った.

1.骨髄異形性症候群におけるエキソーム解析


 解析を行った症例は,骨髄異形性症候群18例,慢性骨髄単球性白血病4例,二次性急性骨髄性白血病7例を含む計29例で,腫瘍細胞およびそれぞれの正常対照細胞のゲノムDNAについて全エキソン配列の濃縮を行ったのち,次世代シークエンサー(イルミナ社のGAIIxないしHiSeq2000)による大量かつ並列の塩基配列決定を行った.平均の解読深度は腫瘍ゲノム配列で140倍,対照ゲノム配列で127倍で,80%以上の配列につき20倍以上の解析深度が達成された.ヒトゲノム参照配列とは異なる腫瘍ゲノム配列からデータベースに存在する1塩基多型(SNP)に一致する配列を除いたのち,対照ゲノム配列に対して有意に高いアレル頻度を示す1塩基変異(SNV)および微小挿入欠失(indel)を体細胞変異の候補として抽出した.こうして同定された492個の体細胞変異の候補についてSanger法による塩基配列決定により検証を行うことで,最終的に計268個(1試料あたり9.2個)の体細胞変異が同定された.1試料あたりの変異の数はこれまでに報告されている固形腫瘍における変異数より有意に少ないが,急性骨髄性白血病や慢性リンパ性白血病における変異数とはほぼ同じ程度であった.268個の変異のうち,33個(12%)は骨髄異形性症候群において変異の報告のある15遺伝子に生じた変異で,残り235個は未知の遺伝子に生じた変異であった.ドライバー変異という観点からとくに興味のもたれたのは複数の試料でくり返して変異を認めた12の遺伝子で,この12遺伝子のうち8遺伝子は,ASXL1遺伝子,TET2遺伝子,EZH2遺伝子,DNMT3A遺伝子,RUNX1遺伝子を含む,これまで骨髄異形性症候群において変異遺伝子として報告のある遺伝子であった.一方,残り4つの遺伝子は今回の解析で新たに見い出されたもので,興味深いことにそのうちの3つ,SRSF2遺伝子,U2AF35遺伝子,ZRSR2遺伝子はRNAスプライシングにかかわるタンパク質をコードする遺伝子であった.単一の例で変異の認められたSF3A1遺伝子,SF3B1遺伝子,PRPF40B遺伝子を含めると,29試料のうち16試料でRNAスプライシングにかかわる遺伝子の変異が認められた.

2.骨髄系の腫瘍におけるRNAスプライシング変異の解析


 29試料のエキソーム解析で得られたRNAスプライシング変異に関するこの知見を確認する目的で,さまざまな病型を含む計582例の骨髄系の腫瘍について,さきの6つの遺伝子を含む計9個のRNAスプライシングタンパク質をコードする遺伝子について網羅的な変異解析を行った.582例のゲノムDNAを1プールあたり12試料にて等量混合した計49個のプールについて,9個の遺伝子の全エキソンを次世代シークエンサーにより解析した.変異の同定された各プールの個々の試料について,Sanger法による塩基配列決定により変異の確認と変異を生じた試料の特定を行った.こうした変異解析の結果,RNAスプライシングにかかわる8遺伝子について計219個の変異が確認された.変異のほとんどはSRSF2遺伝子,SF3B1遺伝子,U2AF35遺伝子,ZRSR2遺伝子の4つの遺伝子に生じており,これらにつづいて,SF3A1遺伝子,U2AF65遺伝子,SF1遺伝子に変異が確認された.これらの変異は骨髄異形性症候群およびこれに関連した病型において45%~85%という高い頻度で認められており,なかでも環状鉄芽球の増加を特徴とする骨髄異形性症候群の病型においては約85%というきわめて高い頻度で変異が認められた.また,骨髄異形性症候群に由来する急性骨髄性白血病の含まれる二次性白血病においても25%内外という頻度で変異が認められた.一方,骨髄異形性症候群に由来しない急性骨髄性白血病や骨髄増殖性疾患において変異の頻度は低く,RNAスプライシングタンパク質の変異が骨髄異形性症候群およびその関連疾患においてほぼ特異的に生じていることが確認された.特筆すべきは,これらのRNAスプライシングタンパク質における変異はほとんど互いに重複することなく排他的に生じていたことで,このことは,これらの変異がRNAスプライシングという機能的な経路を共通の標的として生じたことを遺伝学的に強く示唆する結果であると考えられた.

3.RNAスプライシング経路


 いうまでもなく,真核生物において遺伝子はゲノムの異なるセグメント(エキソン)に介在する配列(イントロン)を隔てコードされている.その発現に際しては,遺伝子はイントロンを含めたかたちでいったんゲノムDNAからmRNA前駆体に転写されたのち,イントロンが切り出されエキソンの再結合が行われて最終的な成熟mRNAが産生される.このいっけんまわりくどい分子機構は,選択的スプライシングにより成熟mRNAを構成するエキソンを多様に選択することでかぎられた遺伝子数のもと生成されるタンパク質の多様性を実現する基本的なしくみをあたえており,ヒトでは約76%の遺伝子が選択的スプライシングをうけるものと推定されている.RNAスプライシングはこのmRNA前駆体から成熟mRNAの産生を実現する分子機構であり,真核生物の遺伝子発現において決定的に重要な役割を担っている.RNAスプライシングにおいては,mRNA前駆体で多数のスプライシングにかかわるタンパク質のリクルートと解離がくり返され,この過程をつうじエキソン-イントロン構造が認識されて最終的にイントロンが排除される.その最初の段階では,U1 snRNA複合体によりmRNA前駆体の5’側スプライス部位の認識が行われ,つづいて,U2AFヘテロ二量体を含むタンパク質複合体による3’側スプライス部位の認識が行われたのち(E複合体),SF3A1SF3B1を含む多数のサブユニットから形成されるU2 snRNA複合体が3’側スプライス部位にリクルートされて(A複合体),そののち,2つのエステル基転移反応をへてイントロンがラリアット配列として除去される.U2AF35とU2AF65からなるU2AFヘテロ二量体は,U2AF35を介してエキソンとイントロンの境界に結合する一方,U2AF65を介して3’側のエキソンのスプライスエンハンサー配列に結合するSRSF2および分岐点となる配列を認識するSF1と相互作用することにより3’側スプライス部位を認識する2)ZRSR2U2AF35と類似したドメイン構造をもっており,進化においてきわめてよく保存されたジンクフィンガーに挟まれたRNA結合ドメインとC末端側のRSドメインから構成される.U2AFヘテロ二量体およびSRSF2からなるタンパク質複合体に存在し,少なくともin vitroではRNAスプライシングに必須の機能を担っている3)
 きわめて興味深いことに,骨髄異形性症候群において変異の認められたスプライシングタンパク質は機能の詳細が不明なPRPF40Bを除きすべてが3’側スプライス部位の認識にかかわっており,排他的な変異様式とあわせ,これらの変異がRNAスプライシングにおいて3’スプライス部位の認識を障害することにより骨髄異形性症候群の発症にかかわっていることが示唆された(図1).




4.骨髄異形性症候群におけるRNAスプライシング変異の特徴


 骨髄異形性症候群におけるRNAスプライシングタンパク質の変異はE複合体およびA複合体の形成にかかわる少なくとも7つのタンパク質に生じていたが,これらのうち,U2AF35,SRSF2SF3B1において変異は特定のアミノ酸残基に生ずる強い傾向が認められた.すなわち,U2AF35では変異はエキソンとイントロンの境界での塩基の結合にかかわる2つのジンクフィンガーの高度に保存された2つのアミノ酸残基に集中的に生じており,SRSF2では2つの機能ドメインのあいだの配列に存在する95番目のプロリン残基に選択的に生じていた.さらに,SF3B1においても700番目のリジン残基がグルタミン酸残基となる変異を主要なものとしておもに4つのアミノ酸残基に変異が生じていた.こうした変異のホットスポットの存在することから,これらの変異が単純な機能喪失変異ではなく機能獲得型の変異である可能性が示唆された.
 環状鉄芽球の増加を示す骨髄異形性症候群の病型とSF3B1の変異との関連は特筆すべきことであり,その割合は78%に達した.また,これほど顕著ではないが,慢性骨髄単球性白血病ではSRSF2の変異の頻度が有意に高くなっていた.このことから,これら一連の変異がRNAスプライシング経路を共通の機能的な標的としつつも,個々の遺伝子に特異的な機能とその障害が病型に反映されている可能性が示唆された.たとえば,SRSF2はRNAスプライシングにかかわる機能のほか,転写の開始および転写産物の延長にも関与しており,それらの機能の低下により突然変異率の上昇が誘発されることが示されている.こうした個々の遺伝子の機能の特性とその異常による病型の差異については今後の検討が必要である.

5.U2AF35の変異がRNAスプライシングに及ぼす効果


 骨髄異形性症候群における一連のRNAスプライシングタンパク質の変異がRNAスプライシングの異常を誘発しているかどうかは興味深い問題であった.この点を検証する目的で,U2AF35遺伝子をHela細胞に導入し誘導的に発現させることで変異型U2AF35がRNAスプライシングに及ぼす効果を検討した.野生型U2AF35あるいは変異型U2AF35を誘導的に発現させた細胞からRNAを抽出しAffymetrix社のエキソンアレイを用いて解析した.これには参照配列データベースであるRefSeqに登録されているエキソンのプローブにくわえ,イントロンに相当すると思われる多数のプローブが設計されている.そこで,野生型U2AF35を発現させた細胞と変異型U2AF35を発現させた細胞とのあいだで有意にシグナル強度の異なるプローブを解析したところ,野生型U2AF35を導入した細胞ではエキソンのプローブのシグナルが増強するのに対し,変異型U2AF35を導入した細胞ではイントロンに相当するプローブのシグナルの増強が認められた.このことから,変異型U2AF35を導入した細胞ではイントロンの除去すなわちスプライシングが障害されていることが示唆された.野生型U2AF35を導入した細胞および変異型U2AF35を導入した細胞から抽出したmRNAを大量かつ並列の塩基配列決定により解析したところ,変異型U2AF35を導入した細胞ではエキソンをもつmRNAの発現が相対的に減少するとともに,イントロン,エキソンとイントロンの境界の配列,遺伝子間の配列をもつmRNAの発現が有意に上昇していることが示された.さらに興味深いことに,この2つの細胞の遺伝子発現プロファイルに対し遺伝子セット濃縮解析(gene set enrichment analysis:GSEA)を行ったところ,変異型U2AF35を導入した細胞ではナンセンス変異依存性分解(nonsense mediated decay:NMD)にかかわる遺伝子の発現の有意な上昇が認められ,これらの遺伝子発現の上昇は定量的PCR法でも確認された.ナンセンス変異依存性分解はコード領域の途中に終止コドンをもつmRNAを検出しこれを排除する分子機構であるが4),変異型U2AF35を導入した細胞においてその活性化が認められたことは,これらの細胞でRNAスプライシングの異常によりmRNAにイントロンが残された,あるいは,異常なスプライシングによりコード領域の途中に終止コドンをもつmRNAの産生が亢進していることを間接的に示唆する結果であると考えられた.

6.U2AF35の変異生物学的な効果


 RNAスプライシングタンパク質の変異がどのようにして骨髄異形性症候群の発症にかかわるのだろうか? 現時点ではその詳細は不明である.この点について変異型U2AF35がHela細胞の増殖に及ぼす効果を検討した.変異型U2AF35を導入した細胞では予想に反して細胞増殖の顕著な抑制が観察され,このことと関連して細胞周期の停止と細胞死の誘導が観察された.この効果は骨髄異形性症候群に由来するTF1細胞や32D細胞などほかの細胞種でも確認された.さらに,マウスの骨髄から単離した造血幹細胞の画分に野生型U2AF35あるいは変異型U2AF35を導入し,放射線を照射したマウスに正常幹細胞とともに移植したのち,末梢血において導入された細胞系列の割合を測定した.6週間後の観察では変異型U2AF35を導入した幹細胞を移植したマウスでは導入された細胞系列が有意に低下していたことから,変異型U2AF35が造血に対し抑制的に作用している可能性が示唆された.

おわりに


 骨髄異形性症候群のエキソーム解析によりRNAスプライシングにかかわる複数のタンパク質が遺伝子変異により高頻度に変異をきたしていることが明らかになった.これらの変異は互いに重複することなく排他的に生ずる傾向を示していたことから,RNAスプライシングという共通の機能を標的とした変異であることが示された.これらのタンパク質のひとつであるU2AF35について,変異型U2AF35を導入した細胞ではRNAスプライシングの変異が誘発された.これらの変異は骨髄異形性症候群の特徴をもつ骨髄系の腫瘍に特徴的かつ高頻度に認められたことから,骨髄異形性症候群とほかの骨髄系の腫瘍との病態の相違を説明する重要な手かがりとなる可能性が示唆された.
 一方,これらの変異と骨髄異形性症候群の病態との機能的な因果関係については多くが不明である.これらの変異タンパク質は遺伝学的にはクローン選択をうけていることは明らかであるが,変異タンパク質を導入した細胞ではむしろ細胞周期の停止と細胞死の増加をともなう増殖抑制が認められ,いっけん矛盾する観察結果が得られた.今回の検討において細胞増殖の抑制にはたらいているようにみえる変異タンパク質がクローン選択に作用する分子機構の解明は骨髄異形性症候群の分子病態を理解するうえで重要な点かもしれない.実際に,腫瘍クローンの無制限な増殖により特徴づけられる急性骨髄性白血病とは対照的に,骨髄異形性症候群ではクローン選択が作用しているものの腫瘍の増殖は無制限ではなく,細胞死をともなう無効造血による骨髄不全がその病態の顕著な特徴となっている.骨髄異形性症候群の病型により変異の種類の異なる理由も現時点ではまったく不明である.変異の見い出された個々のタンパク質について,その機能的な特徴と変異により生じる効果の分子論的および生物学的な理解が不可欠である.今後の研究の課題は多い.

文 献



  1. Bejar, R., Levine, R. & Ebert, B. L.: Unraveling the molecular pathophysiology of myelodysplastic syndromes. J. Clin. Oncol., 29, 504-515 (2011)[PubMed]

  2. Wahl, M. C., Will, C. L. & Luhrmann, R.: The spliceosome: design principles of a dynamic RNP machine. Cell, 136, 701-718 (2009)[PubMed]

  3. Tronchere, H., Wang, J. & Fu, X. D.: A protein related to splicing factor U2AF35 that interacts with U2AF65 and SR proteins in splicing of pre-mRNA. Nature, 388, 397-400 (1997)[PubMed]

  4. Bhuvanagiri, M., Schlitter, A. M., Hentze, M. W. et al.: NMD: RNA biology meets human genetic medicine. Biochem. J., 430, 365-377 (2010)[PubMed]



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著者プロフィール


小川 誠司(Seishi Ogawa)
略歴:1993年 東京大学大学院医学系研究科博士課程 修了,1994年 東京大学医学部附属病院 非常勤医員,1997年 同 助手,2002年 東京大学大学院医学系研究科 客員助教授,2006年 同 特任准教授を経て,2008年より東京大学医学部附属病院 特任准教授.
研究テーマ:分子遺伝学および分子生物学による疾患の理解と克服.

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