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反復した社会挫折ストレスは前頭前皮質においてToll様受容体TLR2およびTLR4を介してミクログリアを活性化し社会忌避行動をひき起こす

北岡志保・聶  翔・古屋敷智之
(神戸大学大学院医学研究科 薬理学分野)
email:北岡志保古屋敷智之
DOI: 10.7875/first.author.2018.078

The innate immune receptors TLR2/4 mediate repeated social defeat stress-induced social avoidance through prefrontal microglial activation.
Xiang Nie, Shiho Kitaoka, Kohei Tanaka, Eri Segi-Nishida, Yuki Imoto, Atsubumi Ogawa, Fumitake Nakano, Ayaka Tomohiro, Kazuki Nakayama, Masayuki Taniguchi, Yuko Mimori-Kiyosue, Akira Kakizuka, Shuh Narumiya, Tomoyuki Furuyashiki
Neuron, 99, 464-479.e7 (2018)




要 約


 環境からの反復したストレスは脳の炎症をともなう抑うつや不安の亢進をひき起こすといわれている.Toll様受容体などの自然免疫受容体は外来性および内因性のリガンドにより活性化され炎症応答をひき起こす.この研究において,筆者らは,Toll様受容体であるTLR2TLR4のダブルノックアウトマウスにおいて,反復した社会挫折ストレスにより社会忌避行動や不安の亢進が消失し,内側前頭前皮質においてニューロンの神経活動の低下および樹状突起の退縮,ミクログリアの活性化の減弱の起こることを見い出した.内側前頭前皮質のミクログリアにおいて特異的にTLR2およびTLR4をノックダウンしたところ,反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動はみられなくなった.反復した社会挫折ストレスは内側前頭前皮質のミクログリアにおいてTLR2およびTLR4に依存的にインターロイキン1αおよびTNFαの発現を誘導し,内側前頭前皮質においてこれら炎症性サイトカインの機能を阻害すると社会忌避行動はみられなくなった.以上の結果から,反復した社会挫折ストレスはTLR2およびTLR4を介して内側前頭前皮質においてミクログリアを活性化し,炎症性サイトカインを介してニューロンおよび情動行動の変化をひき起こすことが示された.

はじめに


 適度なストレスは交感神経系や視床下部-下垂体-副腎系を活性化し生命の維持に有利にはたらくが,過度なストレスやストレスの遷延化は認知機能の低下や情動行動の変化をひき起こし精神疾患のリスク因子ともなる1-3).ストレスが情動行動の変化をひき起こす機構を明らかにするため,近年では,げっ歯類の反復したストレスのモデルがしばしば用いられる.動物のモデルを用いた研究から,反復したストレスは情動や認知機能を担う脳のさまざまな領域においてニューロンの神経活動や形態を変化させることが報告されている1,3).なかでも,内側前頭前皮質は反復したストレスによる情動行動の変化において重要であり,反復したストレスは内側前頭前皮質における興奮性のシナプス伝達を減少させ,錐体ニューロンの樹状突起の退縮をひき起こす4-6).これと合致して,精神疾患の患者においても内側前頭前皮質における灰白質の減少や神経活動の異常が報告されている7)
 筆者らを含む複数の研究グループは,脳の炎症やミクログリアの活性化が反復したストレスによる情動行動の変化に関与することを報告してきた8).しかし,これらの研究は,ミクログリアの活性化を阻害する薬物や炎症に関連するタンパク質のノックアウトマウスの使用にとどまっており,ミクログリアに選択的な操作はしていないことから,ミクログリアの活性化の機構,また,ミクログリアの活性化が反復したストレスによる情動行動の変化に必須であるかどうかは不明であった.
 ミクログリアには多種多様なパターン認識受容体が発現しており,とくに,Toll様受容体(Toll-like receptor:TLR)はミクログリアの活性化をひき起こすことが示されている9).もともと,Toll様受容体は外来性の抗原を認識し炎症や免疫応答を惹起するパターン認識受容体として同定されたが,近年では,細胞に対するストレスや組織の損傷により放出された内因性のリガンドによっても活性化され炎症や組織の再生をひき起こすことが提唱されている.この研究において,筆者らは,反復した社会挫折ストレスにより内側前頭前皮質において発現の誘導される遺伝子を解析した.

1.TLR2およびTLR4は反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に必須である


 反復した社会挫折ストレスのマウスモデルにおいては,通常のマウスにストレスとして体格が大きく攻撃性の強いICRマウスに1日10分間10日間連続で曝露させる.ストレスに曝露されていないマウスは新奇のICRマウスに対し社会行動を示すが,ストレスに曝露されたマウスは新奇のICRマウスから逃避する社会忌避行動を示す.このモデルにおいては,野生型のマウスの約半数が社会忌避行動を示し,残りの半数は社会忌避行動を示さない10).そこで,社会忌避行動の程度によりストレス感受性のマウスとストレス抵抗性のマウスとに分け,反復した社会挫折ストレスによる情動行動の変化に関与するタンパク質の同定をめざした.遺伝子の発現を網羅的に解析したところ,反復した社会挫折ストレスにより内側前頭前皮質においてS100A8およびS100A9をコードするmRNAの発現が誘導された.これらのタンパク質はToll様受容体などパターン認識受容体の内因性のリガンドとして作用することが報告されている.そこで,TLR2ノックアウトマウスおよびTLR4ノックアウトマウスに反復した社会挫折ストレスをあたえたが,野生型のマウスと同じ程度に社会忌避行動を示した.TLR2TLR4とのあいだに機能的な重複があると考え,TLR2TLR4のダブルノックアウトマウスに反復した社会挫折ストレスをあたえた結果,社会忌避行動および不安の亢進はみられなくなった.これらの結果から,反復した社会挫折ストレスによる情動行動の変化にはTLR2あるいはTLR4が必須であることが示された.

2.TLR2およびTLR4は内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化に必須である


 TLR2およびTLR4はミクログリアに高く発現することから,ミクログリアの活性化のマーカーの免疫染色により,単回の社会挫折ストレスあるいは反復した社会挫折ストレスによるミクログリアの活性化,および,TLR2およびTLR4の関与について検討した.その結果,内側前頭前皮質のミクログリアは単回の社会挫折ストレスの1.5時間後には活性化されていなかったが4時間後には活性化されていた.一方,内側前頭前皮質のミクログリアは反復した社会挫折ストレスの1.5時間後には活性化されており,4時間後にはその活性化は減弱していた.この結果から,反復した社会挫折ストレスにより内側前頭前皮質のミクログリアはプライミングされることが示唆された.内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化はストレスに感受性のマウスでのみ観察された.単回あるいは反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化はTLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスにおいてはみられず,単回あるいは反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化にはTLR2あるいはTLR4が必須であることが示された.他方,側坐核においては単回あるいは反復した社会挫折ストレスによるミクログリアの活性化はみられなかった.これらの結果から,社会挫折ストレスによるミクログリアの活性化は脳の特定の領域において起こることが示された.
 反復したストレスはインターロイキン1受容体I型に依存して末梢から脳の実質への単球の浸潤を促進することが報告されている11)TLR2およびTLR4は単球にも発現することから,反復した社会挫折ストレスによる脳への単球の浸潤におけるTLR2およびTLR4の関与について調べた.その結果,反復した社会挫折ストレスによりミクログリアが活性化される内側前頭前皮質においては,反復した社会挫折ストレスによる単球の浸潤は確認されなかった.一方,内側前頭前皮質の背側に位置する前帯状皮質においては反復した社会挫折ストレスによる単球の浸潤が観察されたが,野生型のマウスとTLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスとでその程度に違いはなかった.これらの結果から,TLR2あるいはTLR4は反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化に必須である一方,反復した社会挫折ストレスによる前帯状皮質への単球の浸潤には必須ではないことが示された.また,インターロイキン1受容体I型のノックアウトマウスにおいて反復した社会挫折ストレスにより社会忌避行動がひき起こされたことから,インターロイキン1受容体I型は必須ではないことが示された.

3.反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質のニューロンにおける神経活動の低下および樹状突起の退縮にTLR2およびTLR4が重要である


 反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質におけるニューロンの機能あるいは形態の変化におけるTLR2およびTLR4の関与について調べた.神経活動のマーカーであるc-Fosの免疫染色により,単回の社会挫折ストレスは野生型のマウスおよびTLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスに対し同様に内側前頭前皮質における神経活動を活性化させることが示された.単回の社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質における神経活動の活性化は,野生型のマウスにおいては事前の反復した社会挫折ストレスにより抑制されたが,TLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスにおいてはその抑制は減弱していた.反復した社会挫折ストレスののちの単回の社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質の神経活動の活性化は,ストレスに感受性のマウスに比べストレスに抵抗性のマウスにおいて有意に亢進していた.多様な反復したストレスが内側前頭前皮質において錐体ニューロンの樹状突起の退縮をひき起こすことが知られている6).反復した社会挫折ストレスは野生型のマウスの内側前頭前皮質において錐体ニューロンの樹状突起の退縮をひき起こしたが,この変化はTLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスにおいてはみられなかった.これらの結果から,反復した社会挫折ストレスによる内側前頭前皮質におけるニューロンの神経活動の低下および樹状突起の退縮にTLR2およびTLR4が関与することが示された.

4.内側前頭前皮質のミクログリアにおいてTLR2およびTLR4は反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に必須である


 反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に関与するTLR2およびTLR4の作用部位を同定するため,Creリコンビナーゼに依存してTLR2およびTLR4をノックダウンする人工のマイクロRNAを発現するレンチウイルスを作製した.ミクログリアにおいて特異的にCreリコンビナーゼを発現するマウスの内側前頭前皮質にこのレンチウイルスを投与したところ,ミクログリアにおいて特異的にTLR2およびTLR4がノックダウンされた.内側前頭前皮質のミクログリアに対照のマイクロRNAを発現させたマウスにおいては反復した社会挫折ストレスにより社会忌避行動がひき起こされたが,内側前頭前皮質のミクログリアにTLR2およびTLR4をノックダウンするマイクロRNAを発現させたマウスにおいては反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動はみられなかった.また,このマイクロRNAのオフターゲット効果は否定された.これらの結果から,内側前頭前皮質のミクログリアに発現するTLR2あるいはTLR4が反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に必須であることが示された.また,内側前頭前皮質のミクログリアにおけるTLR2およびTLR4のノックダウンは,反復した社会挫折ストレスののちの単回の社会挫折ストレスによる神経活動の活性化を亢進した.この結果から,TLR2およびTLR4による内側前頭前皮質におけるミクログリアの活性化は周囲のニューロンの神経活動を抑制することが示された.

5.インターロイキン1αおよびTNFαは反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に重要である


 反復した社会挫折ストレスにより活性化されたミクログリアが社会忌避行動をひき起こす分子機序について明らかにするため,TLR2 TLR4ダブルノックアウトマウスの内側前頭前皮質および側坐核からミクログリアを単離し,DNAマイクロアレイを用いて遺伝子の発現を網羅的に解析した.その結果,反復した社会挫折ストレスによるサイトカインをコードする遺伝子の発現の変化の多くはTLR2およびTLR4に依存的であり,なかでも,インターロイキン1αおよびTNFαの発現は内側前頭前皮質のミクログリアに特異的かつTLR2およびTLR4に依存的に上昇した.そこで,内側前頭前皮質に発現するインターロイキン1αおよびTNFαが反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動に関与するかどうかを検討した.社会挫折ストレスをあたえる2時間前にインターロイキン1αあるいはTNFαに対する中和抗体を内側前頭前皮質に投与し,1日に3回の社会挫折ストレスをあたえ,翌日に社会行動を試験した.その結果,対照の抗体を投与したマウスにおいては反復した社会挫折ストレスにより社会忌避行動がひき起こされたが,中和抗体を投与したマウスにおいて社会忌避行動はみられなかった.これらの結果から,活性化したミクログリアから放出されたインターロイキン1αおよびTNFαが反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動において重要であることが示された.

おわりに


 この研究において,筆者らは,反復した社会挫折ストレスが自然免疫受容体であるTLR2およびTLR4を介して内側前頭前皮質においてミクログリアを活性化し,インターロイキン1αおよびTNFαを介してニューロンの神経活動の低下や樹状突起の萎縮,および,社会忌避行動をひき起こすことを示した(図1).



 反復した社会挫折ストレスは内側前頭前皮質においてS100A8およびS100A9の発現を誘導したことから,これらのタンパク質が反復した社会挫折ストレスによるTLR2およびTLR4を介したミクログリアの活性化に関与するかどうかは確認する必要があるだろう.S100A8およびS100A9の発現はストレスに感受性のマウスおよびストレスに抵抗性のマウスの両方に誘導されたが,ストレスに感受性のマウスにおいてのみ内側前頭前皮質のミクログリアが活性化されたことから,ほかのTLR2およびTLR4の内因性のリガンドが内側前頭前皮質において特異的に産生される可能性も残されている.
 多くの研究グループにより,インターロイキン1受容体I型を介した脳への単球の浸潤が反復したストレスによる不安の亢進を担うことが示唆されている.一方,この研究において,インターロイキン1受容体I型の欠損は反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動には影響しないこと,ミクログリアにおいてインターロイキン1RI受容体I型は発現しないことが見い出された.また,TLR2およびTLR4の欠損は反復した社会挫折ストレスによる末梢から前帯状皮質への単球の浸潤に影響しなかった.これらの結果から,反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動および不安の亢進は,炎症に関連する異なる機構により担われることが示された.
 反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動におけるインターロイキン1αおよびTNFαの作用機序は不明である.近年,インターロイキン1αはインターロイキン1βとは異なり,神経傷害性のアストロサイトへと分化させることが報告された12).反復した社会挫折ストレスによりミクログリアから放出されたインターロイキン1αおよびTNFαが,アストロサイトの活性化を介してニューロンの機能および形態の変化を促進する可能性が示唆される.
 ミクログリアの活性化のマーカーのうち,CD68の発現の上昇が反復した社会挫折ストレスによりひき起こされる社会忌避行動の度合いともっとも相関した.CD68は後期エンドソーム/リソソームにおもに局在するスカベンジャー受容体で貪食に関係すると考えられている.反復した社会挫折ストレスにより活性化された内側前頭前皮質のミクログリアがニューロンを構成する成分を貪食する可能性が考えられる.網膜のニューロンにおけるミクログリアによるシナプスの刈り込みにおいて,アストロサイトに由来するTGFβによる補体分子C1qの発現の上昇が重要であることも報告されている13).反復した社会挫折ストレスによりミクログリアから放出されたインターロイキン1αおよびTNFαが,アストロサイトの活性化を介してミクログリアによるニューロンを構成する成分の貪食を促進する可能性も考えられる.
 この研究においては,自然免疫系が精神疾患にともなうストレスに関連する病態の治療のための標的となりうることが提示された.

文 献



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著者プロフィール


北岡 志保(Shiho Kitaoka)
略歴:2008年 京都大学大学院医学研究科にて博士号取得,同年 京都大学iPS細胞研究所 研究員,2011年 京都大学大学院医学研究科 研究員を経て,2014年より神戸大学大学院医学研究科 助教.
研究テーマ:心理ストレスにおける脳-末梢の連関.

聶   翔(Xiang Nie)
2017年 京都大学大学院生命科学研究科博士課程 単位取得退学.

古屋敷 智之(Tomoyuki Furuyashiki)
神戸大学大学院医学研究科 教授.
研究室URL:http://www.med.kobe-u.ac.jp/yakuri

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