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27-ヒドロキシコレステロールによるエストロゲン受容体に依存性の炎症反応を介した動脈硬化の亢進

2014年7月25日

梅渓 通久
(米国Texas大学Southwestern Medical Center,Department of Pediatrics)
email:梅渓通久
DOI: 10.7875/first.author.2014.101

The cholesterol metabolite 27-hydroxycholesterol promotes atherosclerosis via proinflammatory processes mediated by estrogen receptor alpha.
Michihisa Umetani, Pritam Ghosh, Tomonori Ishikawa, Junko Umetani, Mohamed Ahmed, Chieko Mineo, Philip W. Shaul
Cell Metabolism, 20, 172-182 (2014)

要 約

 27-ヒドロキシコレステロールは血中に豊富に存在するコレステロールの代謝産物であるが,血管系においてどのように機能しているかは不明であった.筆者らは,27-ヒドロキシコレステロールの代謝酵素であるCYP7B1の欠損あるいは27-ヒドロキシコレステロールの投与による27-ヒドロキシコレステロールの濃度の上昇は,ApoEノックアウトマウスにおいて脂質代謝に影響することなく動脈硬化を亢進することを見い出した.この効果はエストロゲン受容体αに依存的であり,また,27-ヒドロキシコレステロールの投与によりエストロゲンによる動脈硬化の予防効果が失われた.27-ヒドロキシコレステロールは単球あるいはマクロファージにおいて炎症性遺伝子の発現を亢進し血管内皮細胞への接着を促進した.マウスにおいてリンパ球の血管内皮への接着は27-ヒドロキシコレステロールの投与によりエストロゲン受容体に依存的に亢進した.エストロゲンは血管内皮細胞においてNF-κBの活性化を抑制することが知られているが,27-ヒドロキシコレステロールは逆にこれを促進し,その作用はErk1/Erk2およびJNKに依存性のIκBαの分解によるものと考えられた.したがって,27-ヒドロキシコレステロールはエストロゲン受容体αに依存性の炎症反応を惹起し,エストロゲンによる動脈硬化の抑制作用を阻害すると考えられた.これらの結果から,27-ヒドロキシコレステロールの濃度を低下させることができれば,高脂血症における血管の障害に対し有効となる可能性が考えられた.

はじめに

 酸化ステロールはコレステロールの代謝産物であり,脂質代謝経路においてさまざまな作用をもち,肝臓および末梢組織においては体内からの過剰なコレステロールの排出にかかわる.27-ヒドロキシコレステロールは血中に豊富に存在する酸化ステロールであり,P450酵素であるCYP27A1によりコレステロールから生合成され,同じくP450酵素であるCYP7B1により代謝される1).最近,筆者らは,27-ヒドロキシコレステロールがエストロゲン受容体に結合しその作用を制御していることを明らかにした2).エストロゲンおよびエストロゲン受容体は生殖器官にくわえ体内のさまざまな組織においてはたらくことが知られており,27-ヒドロキシコレステロールも体内において幅広く存在する.27-ヒドロキシコレステロールは体内における存在がはじめて確認された選択的エストロゲン受容体モジュレーターであり,その血中濃度はコレステロールの血中濃度と密接な相関があり,また,加齢により増加することから1),エストロゲン受容体の関与が知られている乳がんや動脈硬化をはじめとした疾患において重要な役割をはたしていると考えられる.
 乳がんにおいて患者の血中および組織中の27-ヒドロキシコレステロールの量,および,その生合成酵素および代謝酵素の発現量を測定したところ,正常な組織と比べ腫瘍組織において27-ヒドロキシコレステロールが多く存在し,腫瘍組織における27-ヒドロキシコレステロール代謝酵素の発現と患者の予後とは逆相関を示すことが見い出だされた3).また,マウスを用いた実験において,27-ヒドロキシコレステロールの投与により乳がんの組織の増殖は有意に亢進し,さらに転移も増加した4).これらの結果から,エストラジオール合成酵素の活性にはかかわりのない27-ヒドロキシコレステロールが,腫瘍の増殖および転移において重要な作用をもつことが明らかになり,乳がんの治療におけるエストラジオール合成酵素阻害剤に対する抵抗性との関連が注目される.
 27-ヒドロキシコレステロールは動脈硬化巣にも豊富に存在し,血中での濃度(150~730 nM)に比べ2桁ほど高い濃度をもつ1).これらのことから,27-ヒドロキシコレステロールは動脈硬化をはじめとした疾患になんらかの生理的な作用を及ぼしていると考えられたが,そのくわしい分子機構については不明であった.今回,筆者らは,ノックアウトマウスおよび薬理学的な手法を用いて27-ヒドロキシコレステロールの動脈硬化の進展における作用を明らかにし,その分子機構の解明を試みた.

1.27-ヒドロキシコレステロールは動脈硬化の進展を促進する

 さきに述べたとおり,コレステロールの血中濃度と27-ヒドロキシコレステロールの血中濃度には密接な相関関係がある.27-ヒドロキシコレステロールによる作用とコレステロールによる作用とを区別するため,動脈硬化のモデルマウスであるApoEノックアウトマウスと,27-ヒドロキシコレステロールの代謝酵素であるCYP7B1のノックアウトマウスとを掛け合わせた.CYP7B1ノックアウトマウスにおいては血中および組織中の27-ヒドロキシコレステロールの濃度は4~5倍に上昇するが,コレステロールおよびトリアシルグリセロールの濃度に影響はない5).また,ApoEノックアウトマウスにおけるコレステロールの血中濃度は高く,それに応じて27-ヒドロキシコレステロールの濃度も高く,その濃度はCYP7B1ノックアウトマウスと同じであった.これら2種のノックアウトマウスを掛け合わせて得られた4種のマウスの表現型を比較することにより,正常あるいは高いコレステロール濃度における異なる濃度の27-ヒドロキシコレステロールの影響,さらに,同じ27-ヒドロキシコレステロール濃度における異なる濃度のコレステロール濃度の影響を,血中におけるリポタンパク質の構成をほとんど変えることなく調べることが可能になった.これらのマウスの6カ月齢および12カ月齢における大動脈の基部の横断面および大動脈の全体において血管への脂肪の沈着を測定したところ,高濃度のコレステロールにより血管への脂肪の沈着はいちじるしく増大したが,オスおよびメスともにコレステロールの濃度にかかわらずCYP7B1の欠損により血管への脂肪の沈着の増大がみられた.以上の結果より,27-ヒドロキシコレステロールは単独で動脈硬化の進展にかかわることが明らかになった.

2.27-ヒドロキシコレステロールはエストロゲンによる動脈硬化の予防作用を阻害する

 酸化ステロールには末梢組織から肝臓への過剰のコレステロールの輸送にかかわったり,酸化ステロールの受容体であるLXRのリガンドであったりするものもあるが,これらはともに動脈硬化を抑制する方向にはたらくため,動脈硬化の進展にはたらく27-ヒドロキシコレステロールの作用機序としては考えにくい.以前に筆者らは,27-ヒドロキシコレステロールがエストロゲン受容体と結合することを明らかにしていたことから2),ApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスを用いてエストロゲンによる動脈硬化の抑制作用に対する27-ヒドロキシコレステロールの効果について調べた.代表的な内在性のエストロゲンである17β-エストラジオールは肝臓におけるCYP7B1の発現を上昇させることが知られており,生理的な濃度の17β-エストラジオールの投与により,ApoEノックアウトマウスでは27-ヒドロキシコレステロールの血中濃度が低下したが,ApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスでは変化はなかった.この条件において,ApoEノックアウトマウスでは17β-エストラジオールにより動脈硬化の病変が対照に比べ約50%の減少がみられたのに対し,ApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスでは17β-エストラジオールによる抑制作用はみられず,ApoEノックアウトマウスよりも大きな動脈硬化の病変がみられた.ところが,高濃度の17β-エストラジオールの投与により,ApoEノックアウトマウスおよびApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスの両方において動脈硬化の進展は抑制された.27-ヒドロキシコレステロールおよび17β-エストラジオールはエストロゲン受容体に対し競合的に結合することから,27-ヒドロキシコレステロールの動脈硬化に対する作用はエストロゲン受容体に結合することにより生じることが示唆された.また,卵巣の除去により内因性のエストロゲンを除去したApoEノックアウトマウスにおいても27-ヒドロキシコレステロールにより動脈硬化の進展がみられたことから,27-ヒドロキシコレステロールは17β-エストラジオールと拮抗するだけではなく,独自の作用ももつことが明らかになった.

3.27-ヒドロキシコレステロールは血管における炎症反応およびマクロファージと血管内皮細胞とにおける炎症性の作用を惹起する

 炎症反応は動脈硬化の進展において重要であり,エストロゲン受容体は炎症反応を抑制する効果をもつことが知られている6,7).そこで,動脈硬化の病変における炎症反応に対する27-ヒドロキシコレステロールの作用について調べた.マクロファージの表面マーカーであるMac3は,ApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスの動脈硬化の病変においてApoEノックアウトマウスよりも高い発現がみられ,マクロファージに特異的な遺伝子であるCD68遺伝子の大動脈における高い発現もみられた.炎症性サイトカインであるインターロイキン6およびTNFαをコードする遺伝子の発現,および,炎症により誘導されるMMP-9遺伝子の発現も,ApoE CYP7B1ダブルノックアウトマウスの大動脈においてはApoEノックアウトマウスよりも高く,CD68遺伝子の発現量あたりのこれらの発現量も有意に高い値を示した.これらのことから,高コレステロール状態において27-ヒドロキシコレステロールはマクロファージの浸潤および炎症反応の亢進をひき起こすことが示された.血管における炎症反応に対する27-ヒドロキシコレステロールの作用を直接的に調べるため,生体顕微鏡を用いてリンパ球の血管壁への接着を観察した.マウスに27-ヒドロキシコレステロールを3日間にわたり投与し,4日目に蛍光色素によりリンパ球を標識して腸間膜動脈の血管壁(血管内皮)に対する接着を測定したところ,未刺激の状態およびTNFαによる刺激の状態のいずれも,27-ヒドロキシコレステロールの投与によりリンパ球の血管内皮に対する接着は亢進した.これらの結果から,血中のコレステロールの状態にかかわらず,27-ヒドロキシコレステロールは血管における炎症反応を惹起することが明らかになった.
 炎症反応に対する27-ヒドロキシコレステロールの作用にかかわる細胞を調べるため,マウスの腹腔内のマクロファージと血管内皮細胞とを用いて細胞培養下において実験を行った.マクロファージに27-ヒドロキシコレステロールを添加したところ,TNFα,インターロイキン1β,インターロイキン6をコードする遺伝子の発現および培地中のタンパク質量が上昇した.これらの反応はエストロゲン受容体αのノックアウトマウスから得たマクロファージでは起こらず,また,LXRαとLXRβのダブルノックアウトマウスから得たマクロファージでは野生型のマウスから得たマクロファージと反応に違いはみられなかった.また,血管内皮細胞においては27-ヒドロキシコレステロールの添加により単球の接着が亢進し,この作用はエストロゲン受容体αの選択的な阻害剤であるMPP,あるいは,エストロゲン受容体αのsiRNAによるノックダウンにより阻害された.以上の結果から,27-ヒドロキシコレステロールは血管内皮細胞およびマクロファージの両方に対し,エストロゲン受容体αに依存性,LXRおよびエストロゲンに非依存性の炎症反応を惹起させることが明らかになった.

4.27-ヒドロキシコレステロールは転写因子NF-κBを活性化する

 炎症反応を惹起する27-ヒドロキシコレステロールの作用機序を解明するため,血管内皮細胞におけるNF-κBの活性化について調べた.動脈硬化におけるNF-κBの作用は多岐にわたるが,マウスを用いた研究から,血管内皮細胞におけるNF-κBの活性化が動脈硬化の進展において重要であることが知られている.未刺激の状態においては,NF-κBはIκBαと結合した状態で細胞質に存在しているが,炎症性の刺激によりIκBαはリン酸化され,このリン酸化によりつづいてユビキチン化される.ユビキチン化されたIκBαはプロテオソームにおいて分解され,IκBαから遊離したNF-κBは核へと移行し,転写因子としてはたらき炎症性遺伝子の発現を誘導する.内在性のエストロゲンである17β-エストラジオールは炎症性の刺激によるNF-κBの核への移行をエストロゲン受容体に依存的に阻害することにより炎症反応を抑制することが知られているため,血管内皮細胞を用い炎症性の刺激の有無によるNF-κBの核への移行に対する27-ヒドロキシコレステロールの作用について調べた.その結果,27-ヒドロキシコレステロールは未刺激の状態においてNF-κBの核への移行を促進し,反対に,17β-エストラジオールはリポ多糖の刺激によるNF-κBの核への移行を抑制した.NF-κBの核への移行を促進する27-ヒドロキシコレステロールの分子機構について調べるため,IκBαのタンパク質量をウェスタンブロット法により測定したところ,27-ヒドロキシコレステロールの濃度に依存してIκBαのタンパク質量は減少した.エストロゲン受容体αをsiRNAによりノックダウンしたところ,IκBαのタンパク質量はリポ多糖の刺激では減少したのに対し,27-ヒドロキシコレステロールの存在下では変化はみられなかった.さらに,IκBαのリン酸化およびそれをひき起こすことの知られている上流のシグナル伝達タンパク質のリン酸化について調べたところ,27-ヒドロキシコレステロールによりIκBαのリン酸化,Erk1/Erk2およびJNKのリン酸化が誘導されたが,P38 MAPキナーゼのリン酸化には変化はなかった.27-ヒドロキシコレステロールのIκBαに対する作用はErk1/Erk2の阻害剤およびJNKの阻害剤により阻害された.以上の結果から,27-ヒドロキシコレステロールは血管内皮細胞における炎症反応において,17β-エストラジオールと同様にエストロゲン受容体αに依存的に,しかし,17β-エストラジオールとは反対の作用をもち,Erk1/Erk2およびJNKを介したIκBのリン酸化によるタンパク質分解,および,それにともなうNF-κBの活性化を誘導することが明らかになった.

5.27-ヒドロキシコレステロールによる炎症反応および動脈硬化の亢進にはエストロゲン受容体が必要である

 さきに述べたとおり,27-ヒドロキシコレステロールは血管内皮細胞においてエストロゲン受容体αに依存的に炎症反応を惹起した.27-ヒドロキシコレステロールによるエストロゲン受容体αに依存的な炎症反応が生体においても起こっているかどうか調べるため,エストロゲン受容体の阻害剤であるICI182,780の存在下において,生体顕微鏡を用いてリンパ球の血管壁への接着に対する27-ヒドロキシコレステロールの作用を観察した.その結果,27-ヒドロキシコレステロールによるリンパ球の血管壁への接着はICI182,780により阻害された.さらに,動脈硬化のモデルマウスであるApoEノックアウトマウスとエストロゲン受容体αノックアウトマウスとを掛け合わせて得られたApoEとエストロゲン受容体αのダブルノックアウトマウスでは,27-ヒドロキシコレステロールによる動脈硬化の病変の増大はみられなかった.以上の結果から,27-ヒドロキシコレステロールはエストロゲン受容体αを介し,単なるエストロゲンの阻害ではなく,独自の作用機序により血管における炎症反応を誘導し,リンパ球の血管壁への接着および動脈硬化を亢進することが明らかになった(図1).

figure1

おわりに

 女性の循環器疾患に対するリスクは閉経ののち急激に増大することが知られており,近年のホルモン補充療法における大規模試験の結果から,とくに閉経ののちある程度の期間をへてからホルモン補充療法を開始してもエストロゲンによる血管保護作用は得られないことが明らかになっている1).この原因についてはいまだ議論は決着していないが,とくに,すでに動脈硬化が存在する場合にこの傾向の強いことが示唆されている.動脈硬化巣には27-ヒドロキシコレステロールが豊富に存在し,また,今回の研究により,27-ヒドロキシコレステロールはコレステロールとは独立してエストロゲン受容体を介して動脈硬化の進展に関与していることを示された.スタチンによるものをはじめ,すでにコレステロールを標的とした治療により動脈硬化を抑制する効果が得られているが,これを補完する治療法ももとめられており,動脈硬化の進展における27-ヒドロキシコレステロールを介したエストロゲン受容体の制御機構を解明することにより,新たな治療法の開発につながることが期待される.

文 献

  1. Umetani, M. & Shaul, P. W.: 27-Hydroxycholesterol: the first identified endogenous SERM. Trends Endocrinol. Metab., 22, 130-135 (2011)[PubMed]
  2. Umetani, M., Domoto, H., Gormley, A. K. et al.: 27-Hydroxycholesterol is an endogenous SERM that inhibits the cardiovascular effects of estrogen. Nat. Med., 13, 1185-1192 (2007)[PubMed]
  3. Wu, Q., Ishikaw, T., Sirianni, R. et al.: 27-Hydroxycholesterol promotes cell-autonomous, ER-positive breast cancer growth. Cell Rep., 5, 637-645 (2013)[PubMed]
  4. Nelson, E. R., Wardell, S. E., Jasper, J. S. et al.: 27-Hydroxycholesterol links hypercholesterolemia and breast cancer pathophysiology. Science, 342, 1094-1098 (2013)[PubMed]
  5. Li-Hawkins, J., Lund, E. G., Turley, S. D. et al.: Disruption of the oxysterol 7α-hydroxylase gene in mice. J. Biol. Chem., 275, 16536-16542 (2000)[PubMed]
  6. Libby, P.: Inflammation in atherosclerosis. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 32, 2045-2051 (2012)[PubMed]
  7. Arnal, J. F., Laurell, H., Fontaine, C. et al.: Estrogen receptor actions on vascular biology and inflammation: implications in vascular pathophysiology. Climacteric, 12(Suppl. 1), 12-17 (2009)[PubMed]

生命科学の教科書における関連するセクションへのリンク

東京大学 大学院総合文化研究科・教養学部附属教養教育高度化機構自然科学教育高度化部門から公開されている生命科学の教科書 “A Comprehensive Approach To LIFE SCIENCE”(羊土社『理系総合のための生命科学 第2版』の英語版)における関連するセクションへのリンクです.

著者プロフィール

梅渓 通久(Michihisa Umetani)
略歴:2000年 東京大学大学院工学系研究科 修了,2002年 米国Texas大学Southwestern Medical Center博士研究員,2007年 同Instructorを経て,2010年より同Assistant Professor.
研究テーマ:コレステロールの代謝産物による核内受容体を介した血管系および代謝系への影響.

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