脂肪酸代謝物によるRNA輸送を介したインフルエンザウイルスの増殖制御機構
今井 由美子
（秋田大学大学院医学系研究科 情報制御学・実験治療学講座）
email：今井由美子
DOI: 10.7875/first.author.2013.049
The lipid mediator protectin D1 inhibits influenza virus replication and improves severe influenza.
Masayuki Morita, Keiji Kuba, Akihiko Ichikawa, Mizuho Nakayama, Jun Katahira, Ryo Iwamoto, Tokiko Watanebe, Saori Sakabe, Tomo Daidoji, Shota Nakamura, Ayumi Kadowaki, Takayo Ohto, Hiroki Nakanishi, Ryo Taguchi, Takaaki Nakaya, Makoto Murakami, Yoshihiro Yoneda, Hiroyuki Arai, Yoshihiro Kawaoka, Josef M. Penninger, Makoto Arita, Yumiko Imai
Cell, 153, 112-125 (2013)
強毒型のインフルエンザウイルスはヒトに感染すると致死的な病態をひき起こす．しかし，重症化したインフルエンザに対する有効な治療法はいまだ開発されていない．筆者らは，脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたスクリーニングと質量分析法による脂肪酸代謝物のリピドミクス解析をとおして，多価不飽和脂肪酸に由来する代謝物プロテクチンD1がウイルスRNAの核外への輸送を抑制することにより，インフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見い出した．プロテクチンD1の産生は12/15リポキシゲナーゼに依存し，重症のインフルエンザ，とくに，強毒型のH5N1ウイルスに感染した肺組織においてはその産生が低下しており，病原性と産生量に負の相関が認められた．また，プロテクチンD1は予防的に投与しても，あるいは，救命のむずかしい感染から48時間以降に投与しても，マウス重症インフルエンザモデルにおいて生存率を改善させたことから，重症インフルエンザの治療薬として有用である可能性が考えられた．
インフルエンザウイルスは弱毒型の季節性インフルエンザウイルスであっても高齢者や妊婦，あるいは，糖尿病，喘息，免疫不全などの合併症のある人が感染すると重症化して死にいたることがある1)．一方，強毒型のH5N1トリインフルエンザウイルスは依然としてトリのあいだで循環しており，ヒトに感染すると呼吸不全や多臓器不全などの致死的な病態を高率にひき起こす2)．ヒトにおいてインフルエンザがいったん重症化するとワクチンや抗インフルエンザ薬はもはや無効となり，集中治療室において人工呼吸をはじめとした救命治療が必要となるが，いままでのところ，重症化したインフルエンザに対し有効な治療法はない．現在，ノイラミニダーゼ阻害薬が抗インフルエンザ薬として使われているが，これらに対し耐性をもつウイルスが出現している．また，ノイラミニダーゼ阻害薬は感染から48時間以内に投与すれば効果があるものの，それを過ぎて投与した場合には効果のないことが報告されている3)．ウイルスは宿主細胞のオルガネラを利用して増殖するので，ウイルスの増殖は宿主因子に依存している．ウイルスが侵入した宿主細胞ではウイルスとの相互作用からさまざまなシグナル伝達系が起動し，これらが重症化の鍵をにぎっているものと考えられる．そこで，ノイラミニダーゼ阻害薬をはじめとするウイルスタンパク質を標的とした抗インフルエンザ薬にくわえ，重症化にかかわる宿主因子を標的にした新しい治療薬が必要であると考えられる．
近年，インフルエンザウイルスと宿主との相互作用に関して，プロテオーム，トランスクリプトーム，デイスラプトームといった網羅的な解析が行われている．デイスラプトームは，網羅的遺伝子破壊実験ともよばれ，対象の遺伝子を破壊して表現型を観察することによりその遺伝子の機能を調べる方法である．インフルエンザウイルスの増殖にかかわる宿主因子に関しても，これまでにRNAi法を用いたゲノムワイドなデイスラプトーム解析が行われている4-6)．しかしながら，DNA，RNA，タンパク質，そしてそのさきで機能する生体内化合物，とくに脂溶性化合物に関しては，ウイルス感染症における動態あるいはウイルスの増殖における役割は不明である．今回，筆者らは，脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたスクリーニングと質量分析法による脂肪酸代謝物のリピドミクス解析をとおして7)，多価不飽和脂肪酸に由来する代謝物プロテクチンD1がインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見い出した．これまで，プロテクチンD1は抗炎症作用をもつ脂肪酸代謝物として知られていたが8)，今回，プロテクチンD1は従来の抗インフルエンザ薬と作用機序を異にし，ウイルスRNAの核外への輸送を抑制することにより作用することを見い出した（図1）．
インフルエンザウイルスの増殖を制御する脂肪酸代謝物を探索するため，プロスタグランジン，リゾルビン，プロテクチンなどを含む多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物のライブラリーを用い，インフルエンザウイルスPR8株を感染させたヒト肺上皮A549細胞にライブラリーのそれぞれの化合物を投与し，インフルエンザウイルスのNPタンパク質をコードするmRNAの発現量を指標として，インフルエンザウイルスの増殖のスクリーニングを行った．その結果，アラキドン酸に由来する12-HETE，15-HETE，ならびに，ドコサヘキサエン酸に由来する17-HDoHE，プロテクチンD1がインフルエンザウイルスの増殖を抑制することがわかった．ウイルス価の測定やNPタンパク質の免疫染色から，これらのなかでプロテクチンD1がウイルスの増殖抑制効果のもっとも高いことがわかった．プロテクチンD1は強毒型のH5N1ウイルスの増殖を抑制するかどうか，A549細胞を用いて検討したところ，プロテクチンD1の投与によりH5N1ウイルスのMタンパク質をコードするmRNAの発現量およびウイルス価は顕著に低下し，プロテクチンD1は強毒型のH5N1ウイルスの増殖を抑制することが示唆された．
インフルエンザウイルスPR8株をマウスに経気道的に感染させると8日で死亡する．ウイルス価は感染後2日をピークに上昇し，呼吸機能は経時的に悪化する．感染後5日では，炎症細胞の浸潤，肺出血，肺小硝子膜の形成といったヒトの重症インフルエンザ感染に典型的な肺の病理像を示す9)．このマウス重症インフルエンザモデルの肺組織を経時的にサンプリングし，LC-MS/MSによる質量分析法により，アラキドン酸，ドコサヘキサエン酸，エイコサペンタエン酸に由来する脂肪酸代謝物のリピドミクス解析を行った．その結果，脂肪酸代謝物ライブラリーのスクリーニングによりウイルス増殖の抑制効果を示した化合物，12-HETE，15-HETE，17-HDoHE，および，プロテクチンD1は，いずれも感染ののちのすべての経過をとおし，対照のマウスに比べ産生の低下していることがわかった．つぎに，病原性の異なるウイルスを野生型マウスに経鼻感染させ，肺組織を経時的にサンプリングし同様のリピドミクス解析を行った．その結果，プロテクチンD1の産生は強毒型のH5N1ウイルスに感染したマウスの肺では産生の低下を認めた一方，弱毒型のウイルス10) に感染したマウスの肺では産生は亢進しており，ウイルスの病原性とプロテクチンD1の産生量に負の相関を認めた．
スクリーニングによりインフルエンザウイルスの増殖抑制のみられた脂肪酸代謝物に関して，マウス重症インフルエンザモデルを用いてin vivoにおける効果を検討した．12-HETE，15-HETE，17-HDoHE，あるいは，プロテクチンD1をそれぞれマウスあたり1μg，感染前12時間と感染の直後に静脈内投与した．対照となるマウスでは8日で全例が死亡したが，プロテクチンD1を投与したマウスでは8日以降も40％のマウスが生存し生存率が有意に改善した．一方，スクリーニングによりウイルスの増殖抑制効果のみられなかった脂肪酸代謝物のうち，抗炎症作用をもつことが報告されているものについてはマウスの生存率を改善させることはなかった．プロテクチンD1の投与により感染した肺組織において炎症性サイトカインやインターフェロンの産生に変化のなかった一方，ウイルスの増殖は有意に抑制された．したがって，プロテクチンD1の重症インフルエンザに対する効果は抗炎症作用によるものではない可能性が考えられた．
プロテクチンD1の投与によりインフルエンザウイルスの増殖が抑制される分子機構について検討した．培養細胞においてもプロテクチンD1の投与によりインターフェロンβの発現は変化しなかったので，プロテクチンD1によるウイルスの増殖抑制は抗ウイルス応答によるものであるとは考えにくかった．そこで，プロテクチンD1はインフルエンザウイルスのライフサイクル自体を制御しているのではないかと考えた．インフルエンザウイルスはマイナス鎖の一本鎖RNAをゲノムにもつRNAウイルスであり，ゲノムは8本の分節に分かれている．ほかのRNAウイルスとは異なり，インフルエンザウイルスではゲノムRNAの複製および転写が感染した宿主細胞の核において行われるという特徴がある．すなわち，核においてウイルスのゲノムRNAに宿主細胞のmRNAから切り取られたキャップ構造とポリA構造が結合してmRNAの転写が行われ，このmRNAは細胞質へと核外輸送されてウイルスタンパク質に翻訳される．また，核においてウイルスのゲノムRNAを鋳型としてcRNAが合成され，それを鋳型として多コピーのゲノムRNAが複製される．複製されたゲノムRNAはタンパク質と複合体を形成して核外へと輸送される11)．そこで，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの動態を調べるため，蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いてその細胞内局在の変化を経時的に観察した．その結果，mRNAは感染後3時間から核における発現がみられ，感染後5時間から8時間にかけて細胞質における強い発現へと変わっていくことがわかった．ゲノムRNAは感染後5時間から核において発現が認められ，感染後8時間で細胞質において強い発現がみられた．ところが，プロテクチンD1を投与すると，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAはともに感染後8時間においても核にとどまっていて，ウイルスRNAの核外への輸送が顕著に抑制されていることがわかった．
宿主細胞におけるmRNAの核外輸送にはNXF1が特異的な輸送受容体として機能していることが知られている12,13)．NXF1に輸送受容体の小サブユニットであるNXT1/p15が結合してヘテロ二量体を形成し，このヘテロ二量体が積み荷であるmRNAの核膜孔の通過を促進すると考えられている．NXF1をsiRNAによりノックダウンしたところ，インフルエンザウイルスの増殖は特異的に抑制されること，また，感染後8時間においてウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの核から細胞質への輸送は抑制されることがわかった．したがって，NXF1はインフルエンザウイルスのRNAの核外への輸送を促してウイルスの増殖を促進させていることが示唆された．FGリピート配列をもつFGヌクレオポリンはNXF1に結合してRNAの核外輸送に関与することが知られている14,15)．インフルエンザウイルスの増殖はFGヌクレオポリンのうちNup62のノックダウンにより特異的に抑制されることがわかった．そこで，インフルエンザウイルスのRNAとNXF1あるいはNup62との直接的な結合について調べるため，in vitro RNAゲルシフトアッセイを行った．NXF1を添加すると濃度依存的にウイルスのゲノムRNAならびmRNAにバンドシフトがみられ，NXF1とインフルエンザウイルスのRNAは直接的に結合することがわかった．一方，Nup62の添加ではバンドシフトは認められなかったので，Nup62はインフルエンザウイルスのRNAと直接的には結合しないと考えられた．興味深いことに，NXF1とNup62を共存させると，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAのバンドに大きなシフトがみられた．このことから，NXF1とNup62は結合してタンパク質複合体を形成し，これがインフルエンザウイルスのRNAと直接的に結合すると考えられた．
プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を抑制することによりウイルスの増殖を抑制しているのではないかと仮説をたてた．これを検証するため，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAとNXF1との結合を，抗NXF1抗体を用いたRNA免疫沈降法を用いて検討した．抗NXF1抗体と結合しているRNAを抽出し，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの発現量を定量的RT-PCR法により測定したところ，プロテクチンD1の投与によりNXF1-Nup62複合体と結合するウイルスのRNA量を抑制できることがわかった．さらに，抗NXF1抗体と結合しているRNAについてディープシークエンス解析を行ったところ，すべてのセグメントのウイルスRNAに関して，プロテクチンD1の投与により抗NXF1抗体と結合するRNAの減少を認めた．ところで，NXF1は宿主細胞においてmRNAの核外輸送に関与していることが知られている．そこで，プロテクチンD1は宿主細胞におけるmRNAの核外輸送を抑制するかを検討した．まず，ポリAをもつmRNAの蛍光in situハイブリダイゼーション解析を行ったところ，プロテクチンD1の投与により核外輸送は影響をうけなかった．さらに，宿主細胞に由来するmRNAに関し核画分と細胞質画分についてディープシークエンス解析を行ったが，プロテクチンD1の投与は宿主細胞のmRNAの動態には大きな影響をあたえなかった．したがって，プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を特異的に抑制することにより，インフルエンザウイルスの増殖を抑制していることが示唆された．
12/15リポキシゲナーゼはプロテクチンD1の主要な産生経路にあることが知られている16)．野生型マウスと12/15リポキシゲナーゼノックアウトマウスに対し経気道的にインフルエンザウイルスを感染させ，多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物のリピドミクス解析を行った．その結果，プロテクチンD1およびその上流の17-HDoHEの産生はインフルエンザウイルスの感染あるいは非感染にかかわらず12/15リポキシゲナーゼノックアウトマウスにおいて著しく低値をとったことから，インフルエンザに感染したマウスにおけるプロテクチンD1の産生は12/15リポキシゲナーゼに依存していることがわかった．また，重症インフルエンザマウスモデルにおいてはウイルスの感染にともない12/15リポキシゲナーゼの発現が経時的に低下しており，これがプロテクチンD1の産生の低下につながっている可能性が示唆された．
重症インフルエンザの治療における問題点のひとつは，現在，使われている抗インフルエンザ薬（ノイラミニダーゼ阻害薬）は，感染から48時間以内に投与すれば効果のあるものの，それを過ぎて投与した場合には効果がないという点である3)．今回の検討から，プロテクチンD1はウイルスの増殖抑制に関してノイラミニダーゼ阻害薬とは作用機序を異にすることがわかったので，この2つの薬剤を併用することにより感染から48時間がたった重症インフルエンザマウスを救命できないかと考えた．重症インフルエンザモデルマウスにおいて，ノイラミニダーゼ阻害薬ペラミビルを単独で感染後48時間に投与すると65％のマウスが死亡したが，プロテクチンD1とペラミビルを併用すると感染後48時間の投与でも全例を救命することができた．これらのことから，プロテクチンD1は予防的に投与しても，また，感染ののち治療的に投与しても，重症インフルエンザに対し有効である可能性が示唆された．
これまでに，プロテクチンD1をはじめとした多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物は抗炎症作用をもつことが知られていたが8)，今回，筆者らは，プロテクチンD1にウイルスの増殖抑制効果のあることを見い出した．その分子機構として，プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を抑制することによりインフルエンザウイルスの増殖を抑制していることがわかった．いままでのところ，インフルエンザウイルスのRNAの核外輸送に関しては，ウイルスタンパク質や宿主細胞のRNA結合タンパク質の関与を含め，全容の解明にはほど遠い．プロテクチンD1がウイルスRNAの核外輸送を抑制する分子機構の詳細について，今後の解明が待たれる．さらに，プロテクチンD1に特異的な受容体はいまだ同定されておらず，プロテクチンD1の作用点やRNAの核外輸送にかかわるシグナル伝達経路に関しても今後の重要な課題である．今回の検討では，感染から48時間が経過した重症インフルエンザマウスモデルに対し，従来の抗インフルエンザ薬（ノイラミニダーゼ阻害薬）と併用することにより生存率を改善させることができた．このことから，プロテクチンD1はこれまで救命のむずかしかった感染から48時間以上の経過した重症インフルエンザにも効果のある可能性が考えられ，重症インフルエンザの治療薬として有用ではないかと考えられた．また，プロテクチンD1の産生とウイルスの病原性とに負の相関を認めたので，重症インフルエンザにおいてはプロテクチンD1が病初期から低値をとることが考えられ，インフルエンザ重症化のバイオマーカーとしても有用であると考えられた．
略歴：1992年 昭和大学大学院医学研究科にて博士号取得，1997年 昭和大学医学部 助手，1999年 カナダToronto大学 博士研究員，2002年 同 アソシエイトサイエンティスト，2003年 オーストリアInstitute of Molecular Biotechnology（IMBA）アソシエイトサイエンティストを経て，2008年より秋田大学大学院医学系研究科 教授．
研究テーマ：脂溶性シグナルによるウイルス病原性の発現機構，メタボロエピジェネティクスからみた急性肺損傷の発症機構，レニン-アンジオテンシン系の新しい生理機能．
抱負：治療につながるような，新しい生命現象や疾患機序の解明をめざしたい．
研究室URL：http://www.imai-lab.com/
© 2013 今井 由美子 Licensed under CC 表示 2.1 日本
（秋田大学大学院医学系研究科 情報制御学・実験治療学講座）
email：今井由美子
DOI: 10.7875/first.author.2013.049
The lipid mediator protectin D1 inhibits influenza virus replication and improves severe influenza.
Masayuki Morita, Keiji Kuba, Akihiko Ichikawa, Mizuho Nakayama, Jun Katahira, Ryo Iwamoto, Tokiko Watanebe, Saori Sakabe, Tomo Daidoji, Shota Nakamura, Ayumi Kadowaki, Takayo Ohto, Hiroki Nakanishi, Ryo Taguchi, Takaaki Nakaya, Makoto Murakami, Yoshihiro Yoneda, Hiroyuki Arai, Yoshihiro Kawaoka, Josef M. Penninger, Makoto Arita, Yumiko Imai
Cell, 153, 112-125 (2013)
要 約
強毒型のインフルエンザウイルスはヒトに感染すると致死的な病態をひき起こす．しかし，重症化したインフルエンザに対する有効な治療法はいまだ開発されていない．筆者らは，脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたスクリーニングと質量分析法による脂肪酸代謝物のリピドミクス解析をとおして，多価不飽和脂肪酸に由来する代謝物プロテクチンD1がウイルスRNAの核外への輸送を抑制することにより，インフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見い出した．プロテクチンD1の産生は12/15リポキシゲナーゼに依存し，重症のインフルエンザ，とくに，強毒型のH5N1ウイルスに感染した肺組織においてはその産生が低下しており，病原性と産生量に負の相関が認められた．また，プロテクチンD1は予防的に投与しても，あるいは，救命のむずかしい感染から48時間以降に投与しても，マウス重症インフルエンザモデルにおいて生存率を改善させたことから，重症インフルエンザの治療薬として有用である可能性が考えられた．
はじめに
インフルエンザウイルスは弱毒型の季節性インフルエンザウイルスであっても高齢者や妊婦，あるいは，糖尿病，喘息，免疫不全などの合併症のある人が感染すると重症化して死にいたることがある1)．一方，強毒型のH5N1トリインフルエンザウイルスは依然としてトリのあいだで循環しており，ヒトに感染すると呼吸不全や多臓器不全などの致死的な病態を高率にひき起こす2)．ヒトにおいてインフルエンザがいったん重症化するとワクチンや抗インフルエンザ薬はもはや無効となり，集中治療室において人工呼吸をはじめとした救命治療が必要となるが，いままでのところ，重症化したインフルエンザに対し有効な治療法はない．現在，ノイラミニダーゼ阻害薬が抗インフルエンザ薬として使われているが，これらに対し耐性をもつウイルスが出現している．また，ノイラミニダーゼ阻害薬は感染から48時間以内に投与すれば効果があるものの，それを過ぎて投与した場合には効果のないことが報告されている3)．ウイルスは宿主細胞のオルガネラを利用して増殖するので，ウイルスの増殖は宿主因子に依存している．ウイルスが侵入した宿主細胞ではウイルスとの相互作用からさまざまなシグナル伝達系が起動し，これらが重症化の鍵をにぎっているものと考えられる．そこで，ノイラミニダーゼ阻害薬をはじめとするウイルスタンパク質を標的とした抗インフルエンザ薬にくわえ，重症化にかかわる宿主因子を標的にした新しい治療薬が必要であると考えられる．
近年，インフルエンザウイルスと宿主との相互作用に関して，プロテオーム，トランスクリプトーム，デイスラプトームといった網羅的な解析が行われている．デイスラプトームは，網羅的遺伝子破壊実験ともよばれ，対象の遺伝子を破壊して表現型を観察することによりその遺伝子の機能を調べる方法である．インフルエンザウイルスの増殖にかかわる宿主因子に関しても，これまでにRNAi法を用いたゲノムワイドなデイスラプトーム解析が行われている4-6)．しかしながら，DNA，RNA，タンパク質，そしてそのさきで機能する生体内化合物，とくに脂溶性化合物に関しては，ウイルス感染症における動態あるいはウイルスの増殖における役割は不明である．今回，筆者らは，脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたスクリーニングと質量分析法による脂肪酸代謝物のリピドミクス解析をとおして7)，多価不飽和脂肪酸に由来する代謝物プロテクチンD1がインフルエンザウイルスの増殖を抑制することを見い出した．これまで，プロテクチンD1は抗炎症作用をもつ脂肪酸代謝物として知られていたが8)，今回，プロテクチンD1は従来の抗インフルエンザ薬と作用機序を異にし，ウイルスRNAの核外への輸送を抑制することにより作用することを見い出した（図1）．
1．脂肪酸代謝物のライブラリーを用いたインフルエンザウイルスの増殖抑制に対するスクリーニング
インフルエンザウイルスの増殖を制御する脂肪酸代謝物を探索するため，プロスタグランジン，リゾルビン，プロテクチンなどを含む多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物のライブラリーを用い，インフルエンザウイルスPR8株を感染させたヒト肺上皮A549細胞にライブラリーのそれぞれの化合物を投与し，インフルエンザウイルスのNPタンパク質をコードするmRNAの発現量を指標として，インフルエンザウイルスの増殖のスクリーニングを行った．その結果，アラキドン酸に由来する12-HETE，15-HETE，ならびに，ドコサヘキサエン酸に由来する17-HDoHE，プロテクチンD1がインフルエンザウイルスの増殖を抑制することがわかった．ウイルス価の測定やNPタンパク質の免疫染色から，これらのなかでプロテクチンD1がウイルスの増殖抑制効果のもっとも高いことがわかった．プロテクチンD1は強毒型のH5N1ウイルスの増殖を抑制するかどうか，A549細胞を用いて検討したところ，プロテクチンD1の投与によりH5N1ウイルスのMタンパク質をコードするmRNAの発現量およびウイルス価は顕著に低下し，プロテクチンD1は強毒型のH5N1ウイルスの増殖を抑制することが示唆された．
2．マウス重症インフルエンザモデルにおける脂肪酸代謝物のリピドミクス解析
インフルエンザウイルスPR8株をマウスに経気道的に感染させると8日で死亡する．ウイルス価は感染後2日をピークに上昇し，呼吸機能は経時的に悪化する．感染後5日では，炎症細胞の浸潤，肺出血，肺小硝子膜の形成といったヒトの重症インフルエンザ感染に典型的な肺の病理像を示す9)．このマウス重症インフルエンザモデルの肺組織を経時的にサンプリングし，LC-MS/MSによる質量分析法により，アラキドン酸，ドコサヘキサエン酸，エイコサペンタエン酸に由来する脂肪酸代謝物のリピドミクス解析を行った．その結果，脂肪酸代謝物ライブラリーのスクリーニングによりウイルス増殖の抑制効果を示した化合物，12-HETE，15-HETE，17-HDoHE，および，プロテクチンD1は，いずれも感染ののちのすべての経過をとおし，対照のマウスに比べ産生の低下していることがわかった．つぎに，病原性の異なるウイルスを野生型マウスに経鼻感染させ，肺組織を経時的にサンプリングし同様のリピドミクス解析を行った．その結果，プロテクチンD1の産生は強毒型のH5N1ウイルスに感染したマウスの肺では産生の低下を認めた一方，弱毒型のウイルス10) に感染したマウスの肺では産生は亢進しており，ウイルスの病原性とプロテクチンD1の産生量に負の相関を認めた．
3．重症インフルエンザに対するプロテクチンD1のin vivoにおける効果
スクリーニングによりインフルエンザウイルスの増殖抑制のみられた脂肪酸代謝物に関して，マウス重症インフルエンザモデルを用いてin vivoにおける効果を検討した．12-HETE，15-HETE，17-HDoHE，あるいは，プロテクチンD1をそれぞれマウスあたり1μg，感染前12時間と感染の直後に静脈内投与した．対照となるマウスでは8日で全例が死亡したが，プロテクチンD1を投与したマウスでは8日以降も40％のマウスが生存し生存率が有意に改善した．一方，スクリーニングによりウイルスの増殖抑制効果のみられなかった脂肪酸代謝物のうち，抗炎症作用をもつことが報告されているものについてはマウスの生存率を改善させることはなかった．プロテクチンD1の投与により感染した肺組織において炎症性サイトカインやインターフェロンの産生に変化のなかった一方，ウイルスの増殖は有意に抑制された．したがって，プロテクチンD1の重症インフルエンザに対する効果は抗炎症作用によるものではない可能性が考えられた．
4．プロテクチンD1によるウイルスRNAの核外輸送の抑制
プロテクチンD1の投与によりインフルエンザウイルスの増殖が抑制される分子機構について検討した．培養細胞においてもプロテクチンD1の投与によりインターフェロンβの発現は変化しなかったので，プロテクチンD1によるウイルスの増殖抑制は抗ウイルス応答によるものであるとは考えにくかった．そこで，プロテクチンD1はインフルエンザウイルスのライフサイクル自体を制御しているのではないかと考えた．インフルエンザウイルスはマイナス鎖の一本鎖RNAをゲノムにもつRNAウイルスであり，ゲノムは8本の分節に分かれている．ほかのRNAウイルスとは異なり，インフルエンザウイルスではゲノムRNAの複製および転写が感染した宿主細胞の核において行われるという特徴がある．すなわち，核においてウイルスのゲノムRNAに宿主細胞のmRNAから切り取られたキャップ構造とポリA構造が結合してmRNAの転写が行われ，このmRNAは細胞質へと核外輸送されてウイルスタンパク質に翻訳される．また，核においてウイルスのゲノムRNAを鋳型としてcRNAが合成され，それを鋳型として多コピーのゲノムRNAが複製される．複製されたゲノムRNAはタンパク質と複合体を形成して核外へと輸送される11)．そこで，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの動態を調べるため，蛍光in situハイブリダイゼーション法を用いてその細胞内局在の変化を経時的に観察した．その結果，mRNAは感染後3時間から核における発現がみられ，感染後5時間から8時間にかけて細胞質における強い発現へと変わっていくことがわかった．ゲノムRNAは感染後5時間から核において発現が認められ，感染後8時間で細胞質において強い発現がみられた．ところが，プロテクチンD1を投与すると，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAはともに感染後8時間においても核にとどまっていて，ウイルスRNAの核外への輸送が顕著に抑制されていることがわかった．
宿主細胞におけるmRNAの核外輸送にはNXF1が特異的な輸送受容体として機能していることが知られている12,13)．NXF1に輸送受容体の小サブユニットであるNXT1/p15が結合してヘテロ二量体を形成し，このヘテロ二量体が積み荷であるmRNAの核膜孔の通過を促進すると考えられている．NXF1をsiRNAによりノックダウンしたところ，インフルエンザウイルスの増殖は特異的に抑制されること，また，感染後8時間においてウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの核から細胞質への輸送は抑制されることがわかった．したがって，NXF1はインフルエンザウイルスのRNAの核外への輸送を促してウイルスの増殖を促進させていることが示唆された．FGリピート配列をもつFGヌクレオポリンはNXF1に結合してRNAの核外輸送に関与することが知られている14,15)．インフルエンザウイルスの増殖はFGヌクレオポリンのうちNup62のノックダウンにより特異的に抑制されることがわかった．そこで，インフルエンザウイルスのRNAとNXF1あるいはNup62との直接的な結合について調べるため，in vitro RNAゲルシフトアッセイを行った．NXF1を添加すると濃度依存的にウイルスのゲノムRNAならびmRNAにバンドシフトがみられ，NXF1とインフルエンザウイルスのRNAは直接的に結合することがわかった．一方，Nup62の添加ではバンドシフトは認められなかったので，Nup62はインフルエンザウイルスのRNAと直接的には結合しないと考えられた．興味深いことに，NXF1とNup62を共存させると，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAのバンドに大きなシフトがみられた．このことから，NXF1とNup62は結合してタンパク質複合体を形成し，これがインフルエンザウイルスのRNAと直接的に結合すると考えられた．
プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を抑制することによりウイルスの増殖を抑制しているのではないかと仮説をたてた．これを検証するため，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAとNXF1との結合を，抗NXF1抗体を用いたRNA免疫沈降法を用いて検討した．抗NXF1抗体と結合しているRNAを抽出し，ウイルスのゲノムRNAならびにmRNAの発現量を定量的RT-PCR法により測定したところ，プロテクチンD1の投与によりNXF1-Nup62複合体と結合するウイルスのRNA量を抑制できることがわかった．さらに，抗NXF1抗体と結合しているRNAについてディープシークエンス解析を行ったところ，すべてのセグメントのウイルスRNAに関して，プロテクチンD1の投与により抗NXF1抗体と結合するRNAの減少を認めた．ところで，NXF1は宿主細胞においてmRNAの核外輸送に関与していることが知られている．そこで，プロテクチンD1は宿主細胞におけるmRNAの核外輸送を抑制するかを検討した．まず，ポリAをもつmRNAの蛍光in situハイブリダイゼーション解析を行ったところ，プロテクチンD1の投与により核外輸送は影響をうけなかった．さらに，宿主細胞に由来するmRNAに関し核画分と細胞質画分についてディープシークエンス解析を行ったが，プロテクチンD1の投与は宿主細胞のmRNAの動態には大きな影響をあたえなかった．したがって，プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を特異的に抑制することにより，インフルエンザウイルスの増殖を抑制していることが示唆された．
5．12/15リポキシゲナーゼ経路による感染した宿主細胞におけるプロテクチンD1の産生
12/15リポキシゲナーゼはプロテクチンD1の主要な産生経路にあることが知られている16)．野生型マウスと12/15リポキシゲナーゼノックアウトマウスに対し経気道的にインフルエンザウイルスを感染させ，多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物のリピドミクス解析を行った．その結果，プロテクチンD1およびその上流の17-HDoHEの産生はインフルエンザウイルスの感染あるいは非感染にかかわらず12/15リポキシゲナーゼノックアウトマウスにおいて著しく低値をとったことから，インフルエンザに感染したマウスにおけるプロテクチンD1の産生は12/15リポキシゲナーゼに依存していることがわかった．また，重症インフルエンザマウスモデルにおいてはウイルスの感染にともない12/15リポキシゲナーゼの発現が経時的に低下しており，これがプロテクチンD1の産生の低下につながっている可能性が示唆された．
6．プロテクチンD1とノイラミニダーゼ阻害薬との併用による重症インフルエンザマウスの救命効果
重症インフルエンザの治療における問題点のひとつは，現在，使われている抗インフルエンザ薬（ノイラミニダーゼ阻害薬）は，感染から48時間以内に投与すれば効果のあるものの，それを過ぎて投与した場合には効果がないという点である3)．今回の検討から，プロテクチンD1はウイルスの増殖抑制に関してノイラミニダーゼ阻害薬とは作用機序を異にすることがわかったので，この2つの薬剤を併用することにより感染から48時間がたった重症インフルエンザマウスを救命できないかと考えた．重症インフルエンザモデルマウスにおいて，ノイラミニダーゼ阻害薬ペラミビルを単独で感染後48時間に投与すると65％のマウスが死亡したが，プロテクチンD1とペラミビルを併用すると感染後48時間の投与でも全例を救命することができた．これらのことから，プロテクチンD1は予防的に投与しても，また，感染ののち治療的に投与しても，重症インフルエンザに対し有効である可能性が示唆された．
おわりに
これまでに，プロテクチンD1をはじめとした多価不飽和脂肪酸に由来する脂肪酸代謝物は抗炎症作用をもつことが知られていたが8)，今回，筆者らは，プロテクチンD1にウイルスの増殖抑制効果のあることを見い出した．その分子機構として，プロテクチンD1はNXF1-Nup62複合体を介したインフルエンザウイルスのRNAの核外輸送を抑制することによりインフルエンザウイルスの増殖を抑制していることがわかった．いままでのところ，インフルエンザウイルスのRNAの核外輸送に関しては，ウイルスタンパク質や宿主細胞のRNA結合タンパク質の関与を含め，全容の解明にはほど遠い．プロテクチンD1がウイルスRNAの核外輸送を抑制する分子機構の詳細について，今後の解明が待たれる．さらに，プロテクチンD1に特異的な受容体はいまだ同定されておらず，プロテクチンD1の作用点やRNAの核外輸送にかかわるシグナル伝達経路に関しても今後の重要な課題である．今回の検討では，感染から48時間が経過した重症インフルエンザマウスモデルに対し，従来の抗インフルエンザ薬（ノイラミニダーゼ阻害薬）と併用することにより生存率を改善させることができた．このことから，プロテクチンD1はこれまで救命のむずかしかった感染から48時間以上の経過した重症インフルエンザにも効果のある可能性が考えられ，重症インフルエンザの治療薬として有用ではないかと考えられた．また，プロテクチンD1の産生とウイルスの病原性とに負の相関を認めたので，重症インフルエンザにおいてはプロテクチンD1が病初期から低値をとることが考えられ，インフルエンザ重症化のバイオマーカーとしても有用であると考えられた．
文 献
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著者プロフィール
略歴：1992年 昭和大学大学院医学研究科にて博士号取得，1997年 昭和大学医学部 助手，1999年 カナダToronto大学 博士研究員，2002年 同 アソシエイトサイエンティスト，2003年 オーストリアInstitute of Molecular Biotechnology（IMBA）アソシエイトサイエンティストを経て，2008年より秋田大学大学院医学系研究科 教授．
研究テーマ：脂溶性シグナルによるウイルス病原性の発現機構，メタボロエピジェネティクスからみた急性肺損傷の発症機構，レニン-アンジオテンシン系の新しい生理機能．
抱負：治療につながるような，新しい生命現象や疾患機序の解明をめざしたい．
研究室URL：http://www.imai-lab.com/
© 2013 今井 由美子 Licensed under CC 表示 2.1 日本
