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ホメオボックス転写因子Msxは胚盤胞の着床の過程における子宮の受容能の獲得に重要な役割を担う

2011年12月19日

大黒多希子・Sudhansu K. Dey
(米国Cincinnati Children’s Hospital Medical Center,Division of Reproductive Sciences)
email:大黒多希子
DOI: 10.7875/first.author.2011.180

Conditional deletion of MSX homeobox genes in the uterus inhibits bastocyst implantation by altering uterine receptivity.
Takiko Daikoku, Jeeyeon Cha, Xiaofei Sun, Susanne Tranguch, Huirong Xie, Tomoko Fujita, Yasushi Hirota, John Lydon, Francesco DeMayo, Robert Maxson, Sudhansu K. Dey
Developmental Cell, 21, 1014-1025 (2011)

要 約

 子宮への胚盤胞の着床は正常な妊娠のため不可欠な過程であり,着床する能力をもつ胚盤胞とそれを受け入れることのできる子宮との相互作用がなければ成立しない.子宮において着床の際に重要な役割を担うタンパク質はいくつか同定されているが,その分子機構の詳細については未知の部分が多い.この研究では,胚の発生において頭蓋顔面や四肢の発達にかかわることの知られているホメオボックス転写因子Msxが,マウスの子宮において正常な着床を誘導するため必要不可欠であることを明らかにした.また,着床のまえにMsxはWnt5aを介してEカドヘリンとβカテニンとの複合体の形成を制御することにより,子宮内膜の管腔上皮細胞における細胞極性を変化させて正常な着床を誘導する可能性を示唆した.これらの発見は,着床機構の解明にくわえ,将来的に不妊治療における妊娠率の上昇にもつながるものと考えられる.

はじめに

 正常な妊娠の誘導と維持はダイナミックで複雑な分子機構をもつ多様な過程により制御されているが,その過程のひとつが子宮への胚盤胞の着床である1).この過程は胚盤胞と子宮の両者が着床にむけ準備の整った状態でなければ成り立たない1,2).筆者らの研究室では,とくに着床のときの子宮に着目して研究を行っている.
 着床の過程を中心として子宮の状態をみたとき,3つの相,前受容期,受容期,非受容期に区別することができる2).このうち胚盤胞が着床できるのは受容期のみであり,この期間は非常に短い.マウスでは妊娠もしくは偽妊娠1日目~3日目に前受容期,4日目に受容期になる(図1a).通常では胚盤胞の子宮への着床は妊娠4日目の22時から24時に起こるが,着床する能力をもった胚盤胞が子宮になければ着床は起こらず,子宮は5日目以降に非受容期になる.これらの子宮における相は卵巣ホルモンであるプロゲステロンとエストロゲンにより制御されている.マウスでは妊娠1日目にエストロゲンにより上皮細胞の増殖が誘導される.妊娠3日目からは黄体から分泌されるプロゲステロンのレベルが上昇し間質細胞の増殖が誘導されるが,この増殖は妊娠4日目の午前に分泌されるエストロゲンによりさらに促進される.一方で,妊娠4日目の午後には管腔上皮細胞は分化し胚盤胞の着床に備える.また,マウスでは妊娠もしくは偽妊娠4日目の午前に卵巣を切除したのちプロゲステロンを投与しつづけることで子宮が受容期となるのを遅延させることができるが,この場合の子宮の状態は中立期といわれる3-5)図1b).この遅延は17βエストラジオールの投与により解除され子宮は受容期に移行する.ただし,着床する能力のある胚盤胞が子宮にない場合には着床は起こらないので,17βエストラジオールの投与ののち24時間以内に子宮はやはり非受容期になる.これらの子宮における3つの相の移行はプロゲステロンとエストロゲンにより厳密に制御されていることが明らかになっているものの,それ以降の分子機構の詳細についてはほとんどわかっていないのが現状である.

figure1

 ホメオボックス転写因子は胚の発生において重要な役割を担うことがよく知られているが,ほとんどの成熟組織ではその役割は制限されている.その唯一の例外が子宮であり,さまざまなホメオボックス転写因子,たとえば,Wnt,BMP,Hedgehogファミリーなどが妊娠中の子宮に発現し着床機構に関与していることが知られている.Msxはもっとも古くから知られるホメオボックス転写因子のひとつであり,下等生物から高等生物まで広く存在し,マウスにはMsx1~Msx3の3つのアイソフォームが存在する6).以前に筆者らは,マウスの子宮においてMsx1が妊娠あるいは偽妊娠4日目の上皮細胞に発現するが,妊娠あるいは偽妊娠5日目以降ではその発現が著しく減少することを見い出した7)図1a).しかしながら,着床不全の表現型を示すLif(leukemia inhibitory factor,白血病抑制因子)のノックアウトマウスの子宮では,妊娠あるいは偽妊娠4日目の上皮細胞には野生型マウスと同様にMsx1が発現するものの,妊娠6日目になってもその発現は減少せず維持されていた(図1a).以上のことから,子宮においてLifがMsx1の発現を制御することにより着床を制御していることが推測された.この研究では,子宮に特異的な遺伝子変異マウスを用いることにより,MsxがWntシグナル伝達系を介してEカドヘリン-βカテニン複合体の形成に影響をあたえ,子宮内膜の管腔上皮細胞における細胞極性を変化させることにより子宮への胚盤胞の正常な着床に寄与していることを示した.

1.子宮におけるMsx1の発現はエストロゲン-Lifシグナル伝達系により制御されている

 着床の前後の子宮におけるMsx1の発現パターンの詳細についてさまざまな手法を用いて検討した.まず,Msx1遺伝子座にlacZ遺伝子をノックインしたマウスの妊娠中の子宮,および,受容期を遅延させたモデルマウスの子宮におけるMsx1の発現パターンの検討から,Msx1が子宮における3つの相の移行に関与していることが示唆された.また,野生型マウスとLifノックアウトマウスについて受容期を遅延させたモデルマウスを作製し,17βエストラジオール,Lif,Msx1の関係を検討したところ,17βエストラジオールにより発現の誘導されたLifがMsx1の発現を減少させることを見い出した(図1b).また,Lifの受容体であるgp130をノックアウトしたマウスの子宮においては,Lifノックアウトマウスと同様に偽妊娠6日目におけるMsx1の発現量の減少がみられなかったことからも,エストロゲン-Lifシグナル伝達系がMsx1の発現を制御していることが示唆された.

2.子宮に特異的なMsx1 Msx2ダブルノックアウトマウスは着床不全の表現型を示す

 in vivoでのタンパク質の機能を解析するにはノックアウトマウスが有用である.しかしながら,Msx1ノックアウトマウスは胎生致死であるため,子宮において特異的にMsx1をノックアウトしたマウスを作製して妊娠中の子宮におけるMsx1の役割を検討した.子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの出産する胎仔の数は正常マウスに比べ有意に少なかった.子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの着床について調べるため妊娠5日目の子宮を観察した.胚盤胞は子宮の上皮細胞に着床するが,そのまわりでは血管透過が上昇するためChicago Blue dyeを尾静脈より注入することで着床した部位を青いバンドで示すことができる.その結果,約40%の子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの子宮では着床部位がまったく検出されなかった.通常では妊娠4日目にはエストロゲンにより間質細胞の増殖が起こるが,その一方で,管腔上皮細胞は増殖が停止し分化がはじまる1).ところが,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの子宮では妊娠4日目でも管腔上皮細胞の増殖が維持され,逆に,間質細胞の増殖は正常マウスに比べ著しく低下していた.これらの結果から,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの子宮では着床に必要な上皮細胞と間質細胞との相互作用に問題があり着床がさまたげられていることが示唆された.
 以上の結果は,Msx1が着床において重要なタンパク質であることを証明していたが,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの表現型は完全な着床不全ではないため,Msx1と高い相同性をもつMsx2が子宮特異的Msx1ノックアウトマウスにおいて代償的に機能しその表現型をレスキューしているという仮説をたてた.この仮説を検証するため,まず,妊娠中の子宮におけるMsx2の発現パターンについて解析を行った.正常マウスの子宮において妊娠1日目~4日目にはMsx2の発現は検出されなかったが,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスの子宮では妊娠4日目の上皮細胞に発現していることを見い出した.つぎに,子宮において特異的にMsx1とMsx2とをノックアウトしたマウスを作製したところ,完全な着床不全を示した.
 さきにLifがMsx1の発現を制御していることを示したが,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスおよび子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスの子宮ではLifの発現を検出できなかった.このことから,着床のまえの子宮ではLifとMsx1とが相互作用していることが推測された.Lifノックアウトマウスの表現型は着床不全であるが,Lifを投与することで着床を誘導できる8).もし,Msx1の機能がLifを介しているのなら,Lifノックアウトマウスと同様にLifの投与により子宮特異的Msx1ノックアウトマウスおよび子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスにおける着床不全を改善できるはずである.しかしながら,そのような表現型のレスキューはできなかったことから,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスが示した着床不全はLifの欠損によるものではないことがわかった.したがって,着床の過程ではLifとMsx1とが相互作用することで機能しているのではなく,LifがMsx1の発現量を減少させることにより機能していることが考えられた.

3.Msxは子宮内膜の管腔上皮細胞において細胞極性を変化させる

 正常な妊娠においては,着床のまえに子宮内膜の管腔上皮細胞は細長くまっすぐな構造となり,それを構成する上皮細胞は縦長の円柱状の形態から立方状の形態に変化することが知られている9).しかしながら,このような上皮細胞の変化が多くの子宮特異的Msx1ノックアウトマウスおよび子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスではみられなかったことから,これらのノックアウトマウスでは上皮細胞における細胞の整合性と細胞極性になんらかの問題があることが示唆された.細胞の整合性と細胞極性は細胞間の接着の状態により制御されている.子宮においては着床のまえにEカドヘリンの細胞外ドメインが切断されることで管腔上皮細胞の細胞間の接着がルーズになることが報告されている10).そこで,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスの子宮においてEカドヘリンとその結合タンパク質であるβカテニンの発現について検討した.着床の前後の子宮において,正常マウスではEカドヘリンの発現が減少したが,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスでは減少せず維持されていた.また,着床のまえの子宮では,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスの管腔上皮細胞では頂膜側と基底膜側との境界においてEカドヘリンとβカテニンとはほぼ同じ局在を示した.さらに,免疫沈降解析のより子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスの子宮ではEカドヘリンとβカテニンとの結合量が正常マウスに比べ多いことが示された.以上の結果から,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスの管腔上皮細胞は正常マウスと比べEカドヘリンとβカテニンとの結合が強く,頂膜と基底膜のあいだで高い極性が保持されていることが示唆された.
 マウスでは着床において栄養膜細胞が管腔上皮細胞と接着するが,この際に頂膜と基底膜のあいだの極性が低くなる必要があるものと考えられている11,12).したがって,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスでの着床不全は頂膜と基底膜のあいだの極性の移行が進行しないことにより起こることが予測された.極性をもった上皮細胞には頂膜側に絨毛と繊毛がみられるが,子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスでは正常マウスに比べ絨毛と繊毛のマーカータンパク質が明らかに頂膜側に局在していることがわかった.以上のことから,Msxの存在しない子宮内膜の管腔上皮細胞では高い細胞極性が保持され,着床が阻害されることが示唆された.

4.MsxはWnt5aの発現制御を介して子宮内膜の管腔上皮細胞における細胞極性を変化させる

 Wnt5aはEカドヘリンとβカテニンとの複合体の形成を促進し細胞極性を誘導することが報告されている13,14)Wnt5a遺伝子座の上流を検索したところ転写因子であるMsxの結合部位が多く存在したことから,子宮においてMsx1がWnt5aを介して管腔上皮細胞の細胞極性を制御していることが推測された.そこで,妊娠中の子宮におけるWnt5aの発現を調べたところ,子宮特異的Msx1ノックアウトマウスおよび子宮特異的Msx1 Msx2ダブルノックアウトマウスでは正常マウスに比べWnt5aの発現が増加していた.また,クロマチン免疫沈降アッセイによりMsx1はWnt5a遺伝子座の上流に結合することがわかった.したがって,子宮ではMsx1がWnt5a遺伝子座の上流に結合しその発現量を抑制していることが示唆された.
 つぎに,子宮内膜の管腔上皮細胞におけるEカドヘリン-βカテニン複合体の形成に対するWnt5aの影響を解析するため,妊娠4日目の子宮内膜から管腔上皮細胞を単離し初代培養細胞系を樹立した.この細胞にWnt5aを添加したところEカドヘリンとβカテニンとの局在性が増加した.さらに,Wnt5aの存在下あるいは非存在下において栄養膜細胞のアウトグロースをみたところ,Wnt5aが存在した場合にはほとんどみられなかった.これらの知見から,余剰のWnt5aは子宮内膜の管腔上皮細胞においてEカドヘリン-βカテニン複合体の形成を促進し,正常な着床の誘導にを阻害することが示唆された(図2).

figure2

おわりに

 出産を望む女性の年齢が高齢化するとともに,不妊治療のニーズもまた年々あがっている.人工授精の精度は日々改良され,人工受精卵のクォリティは上昇し,それにともない不妊治療における妊娠率も上昇しているものの,まだまださまざまな問題が残っている.正常な妊娠の誘導においては受精卵のクォリティだけでなく子宮の側の状態も重要な問題である.しかしながら,妊娠の際の子宮における詳細な分子機構については未知な部分が多い.
 今回,筆者らは,マウスの子宮において着床の際にホメオボックス転写因子であるMsxの発現が変化し,3つの相の移行を制御していることを見い出した.このようなMsxの発現の変化はヒトの子宮でも観察されることが報告されており15-17),マウスと同様に,ヒトにおいてもMsxが子宮における3つの相の移行に関与しているものと考えられる.以上の知見は,マウスやヒトの子宮におけるMsxの発現を制御することにより受容期の期間を延長させることが可能であることを推測させるものである.今後,Msxを中心に着床の際の子宮の側の分子機構の詳細を研究することにより,不妊治療において子宮の状態を安全に制御し妊娠率を向上させる方法が見い出されることが期待される.

文 献

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生命科学の教科書における関連するセクションへのリンク

東京大学 大学院総合文化研究科・教養学部附属教養教育高度化機構自然科学教育高度化部門から公開されている生命科学の教科書 “A Comprehensive Approach To LIFE SCIENCE”(羊土社『理系総合のための生命科学 第2版』の英語版)における関連するセクションへのリンクです.

著者プロフィール

大黒 多希子(Takiko Daikoku)
略歴:2000年 徳島大学大学院薬学研究科博士課程 修了,同年 米国Kansas大学Medical Center博士研究員,2002年 米国Vanderbilt大学Medical Center博士研究員,2004年 同Research Assistant Professor,2008年 米国Cincinnati Children’s Hospital Medical Center Research Assistant Professorを経て,2011年より同Research Associate Professor.

Sudhansu K. Dey
米国Cincinnati Children’s Hospital Medical CenterにてDirector.

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