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ペルオキシソームはミトコンドリアに由来する前駆小胞と小胞体に由来する前駆小胞とのハイブリッドとして新たに形成される

2017年2月23日

杉浦 歩
(カナダMcGill大学Montreal Neurological Institute)
email:杉浦 歩
DOI: 10.7875/first.author.2017.020

Newly born peroxisomes are a hybrid of mitochondrial and ER-derived pre-peroxisomes.
Ayumu Sugiura, Sevan Mattie, Julien Prudent, Heidi M. McBride
Nature, 542, 251-254 (2017)

要 約

 ペルオキシソームは細胞における代謝において中心的なオルガネラのひとつであり,その代謝経路の多くをミトコンドリアと共有する.ペルオキシソームの数は既存のペルオキシソームからの分裂,あるいは,de novo合成により維持される.出芽酵母を用いた研究において小胞体がペルオキシソームのde novo合成における膜の供給源であるとするモデルが確立されつつあるが,哺乳類細胞においてはその理解は遅れている.この研究において,Zellweger症候群の患者に由来するペルオキシソームを欠損した線維芽細胞を用いてペルオキシソームのde novo合成の過程を解析した.顕微鏡によりペルオキシソームの前駆小胞はミトコンドリアの表面において形成されて細胞質に放出されることが観察され,この過程は小胞体に由来するペルオキシソームの前駆小胞を必要とした.この研究により,ペルオキシソームはミトコンドリアに由来する前駆小胞と小胞体に由来する前駆小胞のハイブリッドとして新たに形成されることが示され,哺乳類細胞におけるペルオキシソームのde novo合成について新規のモデルが提唱された.

はじめに

 ペルオキシソームは真核生物のほぼすべての細胞に存在する,脂質二重膜にかこまれたオルガネラである.その機能のうち脂肪酸のβ酸化および過酸化水素の分解についてはよく保存されているが,脂質やアミノ酸の合成および分解などの機能は生物種や組織により多様性をもつ.また,ペルオキシソームは細胞の内部を細胞骨格に依存して動きまわり,細胞の内外の環境に応じて数の変動する,非常にダイナミックなオルガネラでもある.ペルオキシソームの数は既存のペルオキシソームからの成長および分裂,あるいは,de novo合成により維持される1).ペルオキシソームの形成および維持にかかわる一連の遺伝子としてPEX遺伝子が知られており,その変異はペルオキシソームの機能や構造の欠損をひき起こす.このような異常が原因となる疾患はペルオキシソーム形成異常症とよばれ,とくに重篤なZellweger症候群においては複数の器官に異常をきたし乳児期の早期に死亡する.
 ペルオキシソームのde novo合成については酵母のペルオキシソーム欠損変異株を用いた研究がさかんである.出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のペルオキシソーム欠損変異株においては小胞体にいくつかのペルオキシソーム膜タンパク質が局在し2),それらがペルオキシソームの前駆小胞として細胞質に放出されるという,小胞体がペルオキシソーム膜の起源であるとするモデルが確立されつつある3).一方,Hansenula polymorphaのペルオキシソーム欠損細胞株においてはペルオキシソームの前駆体となる膜構造が存在し,小胞体を介さずにペルオキシソームのde novo合成の起こることが報告されており4),ペルオキシソームのde novo合成における膜の起源の多様性も示唆されている.哺乳類細胞においては,一部のペルオキシソーム膜タンパク質が小胞体を経由してペルオキシソームへと輸送されるという報告もあり5),哺乳類においてもペルオキシソームは小胞体を起源とするとする説が広く受け入れられている.しかし,哺乳類のペルオキシソーム欠損培養細胞においては複数のペルオキシソーム膜タンパク質がミトコンドリアに局在することが報告されているにもかかわらず6),それはアーティファクトと解釈され,哺乳類細胞におけるペルオキシソームのde novo合成については未知の部分が多く残されている.この研究においては,哺乳類細胞におけるペルオキシソームのde novo合成経路について明らかにするため,Zellweger症候群の患者に由来するペルオキシソームを欠損した線維芽細胞を用いてペルオキシソームのde novo合成の過程を段階的に解析した.

1.アデノウイルス発現系によりペルオキシソームを欠損した線維芽細胞においてペルオキシソームのde novo合成が回復する

 ペルオキシソームのde novo合成は,膜構造の形成,膜タンパク質の取り込み.マトリックスタンパク質の取り込み,と段階的に起こる.Pex3,Pex16,Pex19はペルオキシソーム膜の形成および維持に必須のタンパク質であり,これらをコードする遺伝子のうちいずれかの欠損はペルオキシソームの欠損をひき起こす.そこで,Pex3遺伝子に変異をもつZellweger症候群の患者に由来する線維芽細胞に,アデノウイルス発現系を用いてPex3と蛍光タンパク質YFPとの融合タンパク質を発現させ,ペルオキシソームのde novo合成の過程を解析した.定量的な評価のため,Pex3-YFP融合タンパク質,膜タンパク質であるPMP70,マトリックスタンパク質であるカタラーゼを免疫蛍光染色し,蛍光顕微鏡により観察した.その結果,ペルオキシソームのde novo合成の過程が段階的に観察され,時間の経過とともに成熟したペルオキシソームの数が増加した.この結果により,アデノウイルス発現系を用いたPex3の発現によりPex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞においてペルオキシソームのde novo合成が回復することが確認された.

2.Pex3はミトコンドリアの表面において小胞様の構造を形成しペルオキシソームの前駆小胞として細胞質に放出される

 これまでの報告にあるように,ペルオキシソームを欠損した細胞においてPex3-YFP融合タンパク質の発現の初期における局在はミトコンドリア様の形態を示した.Pex3-YFP融合タンパク質の局在を確認するため,ミトコンドリアのマーカーである抗Tom20抗体および小胞体のマーカーである抗KDEL抗体を用いて免疫蛍光染色したところ,Pex3-YFP融合タンパク質はミトコンドリアと共局在を示し,小胞体への局在は確認されなかった.生化学的な解析により,Pex3-YFP融合タンパク質は翻訳ののちミトコンドリア外膜に挿入され,そのトポロジーは野生型におけるペルオキシソーム膜と同様に,N末端はオルガネラの内側,C末端は外側をむくことが明らかにされた.内在性のPex14もペルオキシソームを欠損した細胞においてはミトコンドリア外膜に挿入され,そのトポロジーは野生型におけるペルオキシソーム膜と同じであった.Pex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞にPex3-YFP融合タンパク質を発現させると,その局在は時間の経過とともにミトコンドリアからペルオキシソームへと移行し,ペルオキシソームのde novo合成の段階的な進行と一致した.このことから,Pex3はミトコンドリアからペルオキシソームの合成を直接的に制御することが示された.生細胞イメージング法によりPex3-YFP融合タンパク質のミトコンドリアからペルオキシソームへの局在の移行がひとつの細胞において起こることが確認され,さらに,高速の生細胞イメージング法によりミトコンドリアの表面においてPex3-YFP融合タンパク質が小胞様の構造を形成し放出されることが確認された.このときの小胞はミトコンドリアを染色する蛍光色素MitoTrackerに陰性であった.また,ミトコンドリアの表面に存在するペルオキシソームの前駆小胞は,免疫蛍光染色により,Pex3-YFP融合タンパク質および内在性のPex14については陽性,ミトコンドリア外膜タンパク質であるTom20については陰性であった.これらの結果より,ミトコンドリアに由来するペルオキシソームの前駆小胞はカーゴに選択的に形成され細胞質に放出されることが明らかにされた.

3.ミトコンドリアに由来するペルオキシソームの前駆小胞はこれまでに報告されてきたミトコンドリアに由来する小胞とは異なる特徴を示す

 これまでに,筆者らの研究グループは,いくつかのミトコンドリアタンパク質はカーゴに選択的に小胞としてミトコンドリアから放出されリソソームやペルオキシソームといったほかのオルガネラへと輸送されることを報告してきた7,8).この研究において観察されたPex3-YFP融合タンパク質陽性の小胞と,これまでに報告されたミトコンドリアに由来する小胞との関連性について調べるため,いくつかのタンパク質のノックダウンしその影響について調べた.ミトコンドリアは生理的な条件において分裂と融合とをくり返しており,分裂には高分子量GTPaseであるDrp1が必須である9).これまでに報告されたミトコンドリアに由来する小胞はDrp1に非依存的に形成されミトコンドリアから放出されることがわかっていたが,Drp1のノックダウンはPex3-YFP融合タンパク質のミトコンドリアからの放出に影響しなかった.ミトコンドリアに由来する小胞のミトコンドリアからペルオキシソームへの輸送はVps35を含むレトロマー複合体により制御されることが報告されていたが10),Vps35のノックダウンもPex3-YFP融合タンパク質のミトコンドリアからの放出に影響しなかった.Pex19は細胞質のシャペロンであり新規に合成されたペルオキシソーム膜タンパク質をペルオキシソーム膜へと輸送するが6),Pex19のノックダウンはペルオキシソーム前駆体へのPMP70の輸送を阻害したが,Pex3-YFP融合タンパク質のミトコンドリアへの局在およびミトコンドリアからの放出には影響しなかった.
 薬理学的なアプローチによりペルオキシソームのde novo合成の分子機構の解明を試みた.Pex3-YFP融合タンパク質はタンパク質合成阻害剤であるシクロヘキシミドの存在のもと3時間以内に半分以下になった.Pex3-YFP融合タンパク質のターンオーバーのde novo合成における必要性について調べるため,Pex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞にリソソームのATPaseポンプの阻害剤であるバフィロマイシンAあるいはプロテアソームの阻害剤であるMG132を処理し,Pex3-YFP融合タンパク質の量およびペルオキシソームのde novo合成への影響について調べた.バフィロマイシンAはPex3-YFP融合タンパク質の量およびペルオキシソームのde novo合成には影響しなかったことから,Pex3-YFP融合タンパク質は機能的な小胞としてミトコンドリアから放出されることの証拠になった.もしPex3-YFP融合タンパク質が不要なタンパク質としてミトコンドリアから放出されるなら,Pex3-YFP融合タンパク質陽性の小胞が細胞質に蓄積することが予想されるからである.一方,MG132の処理によりPex3-YFP融合タンパク質はミトコンドリアに過剰に蓄積しペルオキシソームのde novo合成は阻害されたことから,Pex3の関与するペルオキシソームのde novo合成にはPex3のユビキチン-プロテアソーム系による分解が必要であることが示唆された.このようにPex3-YFP融合タンパク質がミトコンドリアに過剰に蓄積する条件においても,Pex3-YFP融合タンパク質が小胞体に局在する証拠は得られなかった.
 ペルオキシソームのde novo合成における細胞骨格系の関与について調べた.膜輸送における小胞の放出にはアクチン骨格の重合が必要とされることがあるが,アクチン重合阻害剤であるサイトカラシンDの影響は観察されなかった.一方,微小管重合阻害剤であるノコダゾールの処理によりPex3-YFP融合タンパク質はミトコンドリアに蓄積しペルオキシソームのde novo合成は阻害された.しかし,ノコダゾールによる阻害はRhoキナーゼ阻害剤であるY-27632によりキャンセルされたことから,Rhoキナーゼの活性化による影響であると考えられた.一連の薬理学的な実験においてはペルオキシソームのde novo合成の分子機構の解明にはいたらなかったが,これらの結果から,ペルオキシソームのde novo合成においてはPex3がミトコンドリアから細胞質に放出される必要のあることが示され,ミトコンドリアがペルオキシソーム膜の供給源であることがさらに支持された.
 ミトコンドリアの表面において形成されるペルオキシソームの前駆小胞のより詳細な構造を透過型電子顕微鏡により観察した.Pex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞のクリステ構造に異常は観察されなかったが,ミトコンドリア外膜に小胞様の特徴的な構造が観察された.ミトコンドリアから出芽するような小胞様の構造はミトコンドリアマトリックスや細胞質と比べ電子密度が低く,Pex3-YFP融合タンパク質を発現させることにより有意に大きくなり,その直径は既知のミトコンドリアに由来する小胞よりも大きかった.金コロイドを用いた免疫電子顕微鏡による解析によりPex3-YFP融合タンパク質がこれらの構造に蓄積することも確認された.電子顕微鏡により観察されたミトコンドリアの表面の特徴的な小胞様の構造は,生細胞イメージング法により放出が確認されたミトコンドリアに由来するペルオキシソームの前駆小胞と同一の構造であると考えられた.
 これらの結果より,ミトコンドリアに由来するペルオキシソームの前駆小胞は,これまでに報告されてきたミトコンドリアに由来する小胞とは構造的にも分子機構においても異なる新規の膜構造であることが示された.

4.成熟したペルオキシソームの形成はミトコンドリアに由来する前駆小胞と小胞体に由来する前駆小胞を必要とする

 これまでの結果より,Pex3の関与するペルオキシソームのde novo合成はミトコンドリアを起点とすることが示された.ミトコンドリアに由来するペルオキシソームのde novo合成経路と小胞体との関係について調べるため,Pex16遺伝子に変異をもつZellweger症候群の患者に由来する線維芽細胞を用いた.Pex16はPex3の受容体と報告されており,Pex16の欠損はペルオキシソームの欠損をひき起こす.Pex16遺伝子に変異をもつ線維芽細胞にアデノウイルス発現系を用いてPex16とYFPとの融合タンパク質を発現させると,発現の初期には小胞体に観察されたが,時間の経過とともにカタラーゼ陽性の成熟したペルオキシソームに観察され,これまでに考えられていたように,Pex16の関与するペルオキシソームのde novo合成は小胞体を起源とすることが示された.さらに,内在性のPex14はPex3と同様にミトコンドリアから小胞様の構造として出芽すること,免疫電子顕微鏡によりPex16-YFP融合タンパク質陽性の小胞はミトコンドリアと接着もしくは融合するように観察されたことから,Pex3の関与するミトコンドリアからのペルオキシソームのde novo合成と,Pex16の関与する小胞体からのペルオキシソームのde novo合成は,それぞれ独立した経路ではなく同一の経路であることが示唆された.
 Pex3陽性のペルオキシソームの前駆小胞とPex16陽性のペルオキシソームの前駆小胞との関係について詳細に解析するため,Pex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞にPex3-YFP融合タンパク質とPex16-mRFP融合タンパク質とを共発現させた.すると,Pex3-YFP融合タンパク質はPex16-mRFP融合タンパク質と強い親和性を示して小胞体に局在した.小胞体に局在するPex3-YFP融合タンパク質はPex16-mRFP融合タンパク質とともに小胞様の構造を形成したが,Pex14やPMP70といった内在性のほかの膜タンパク質の取り込みはいちじるしく低下した.このことから,ペルオキシソームの前駆小胞が膜タンパク質を取り込むためにはPex3やPex16だけでは不十分であり,さらに,ミトコンドリアから放出されたPex3陽性のペルオキシソームの前駆小胞は膜タンパク質を取り込むことが示唆された.このPex3-YFP融合タンパク質の局在についての問題を解決するため,Pex3-YFP融合タンパク質をPex16遺伝子に変異をもつ線維芽細胞に,Pex16-mRFP融合タンパク質をPex3遺伝子に変異をもつ線維芽細胞に別々に発現させ,それらの細胞をポリエチレングリコールにより融合させ高速の生細胞イメージング法により解析した.その結果,細胞の融合から3時間ほど経過したところでPex16-mRFP融合タンパク質陽性の小胞様の構造が形成されはじめ,さらに,一部のPex16-mRFP融合タンパク質陽性の小胞がミトコンドリアの表面に形成されたPex3-YFP融合タンパク質陽性の小胞様の構造と融合しミトコンドリアから放出されたのが観察された.
 これらの結果より,哺乳類におけるペルオキシソームのde novo合成は,小胞体からPex16を含む前駆小胞が放出され,ミトコンドリアの表面において形成されたPex3およびPex14を含む前駆小胞と融合し細胞質に放出されるというハイブリッドモデルが提唱された.細胞質に放出されたのち,ペルオキシソームはほかの膜タンパク質やマトリックスタンパク質を取り込むことにより成熟し,成長および分裂により数を増加させる(図1).

figure1

おわりに

 ミトコンドリアおよびペルオキシソームは脂質のβ酸化や活性酸素種の除去などの代謝経路だけでなく,転写因子,形態制御タンパク質,シグナル伝達タンパク質など多くのタンパク質も共有する11).さらに,プロテオーム解析によりペルオキシソームに含まれる酵素の多くはミトコンドリアと同じくαプロテオバクテリオに由来することが明らかにされるなど12),非常に多くの共通点をもつにもかかわらず,その相互関係や制御機構についてはほとんどわかっていなかった.この研究により,ミトコンドリアがペルオキシソームの形成に直接的に関与することが明らかにされ,ミトコンドリアとペルオキシソームとのあいだの関係性の理解について,今後のさらなる発展が期待される.
 出芽酵母はこれまでのペルオキシソームのde novo合成の研究においてよく用いられているが,Pex16遺伝子はもたない.ペルオキシソームの機能は生物種のあいだでの多様性も高く,de novo合成経路の違いからも可塑性の高いオルガネラであるといえる.近年,真核生物のオルガネラの進化において,ミトコンドリアが種々の膜成分の起源であるという説が提唱されている13).この研究において実験的に明らかにされたハイブリッドモデルは,生物種のあいだのペルオキシソームの多様性について新たな説明をあたえるかもしれない.
 哺乳類細胞におけるペルオキシソームのde novo合成に関しては,ながらく,その存在も含め生理的な意義の解明などが遅れをとっていた.この研究において,哺乳類細胞においてはペルオキシソームの“de novo合成が起こるなら”小胞体とミトコンドリアとのハイブリッドとして形成されることが明らかにされた.しかし,なんの処理もしていない野生型の培養細胞においてペルオキシソームのde novo合成が起こるという証拠はいまだ得られていない.今後は,哺乳類を中心として個体レベルにおける解析を進め,ペルオキシソームのde novo合成の生理的な意義について明らかにしたい.

文 献

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著者プロフィール

杉浦 歩(Ayumu Sugiura)
略歴:2012年 東京薬科大学大学院生命科学研究科 修了,同年 カナダMcGill大学 ポストドクトラルフェローを経て,2016年より東京薬科大学生命科学部 プロジェクト研究員.
研究テーマ:オルガネラのダイナミクス,ミトコンドリア,ペルオキシソーム.
抱負:本質にせまりたい.

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