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Notchシグナル制御タンパク質Rumiの基質の認識およびがんに関連する変異の分子基盤

2016年9月5日

竹内英之・Robert S. Haltiwanger
(米国Georgia大学Complex Carbohydrate Research Center)
email:竹内英之
DOI: 10.7875/first.author.2016.092

Structural analysis of Notch-regulating Rumi reveals basis for pathogenic mutations.
Hongjun Yu, Hideyuki Takeuchi, Megumi Takeuchi, Qun Liu, Joshua Kantharia, Robert S. Haltiwanger, Huilin Li
Nature Chemical Biology, 12, 735-740 (2016)

要 約

 RumiはショウジョウバエにおいてNotchシグナル伝達系に必須のタンパク質として同定された,Notchの細胞外ドメインに存在するEGFリピートにグルコースを付加する糖転移酵素である.Rumi遺伝子はヒトを含む哺乳類においても保存されており,その異常はある種の疾患の原因になる.このように非常に重要な機能を担うにもかかわらず,Rumiがどのようにその酵素活性を発揮しEGFリピートを認識するのかは不明であった.この研究において,筆者らは,ショウジョウバエの野生型RumiとEGFリピートとの複合体のX線結晶解析による構造解析に成功した.その結果,RumiはEGFリピートのU字型のループ構造をとるコンセンサス配列および保存された疎水性領域を認識していた.Rumi遺伝子のヒトにおける相同遺伝子であるPOGLUT1遺伝子においてがんおよびDowling-Degos病に見い出された変異はRumiの酵素活性に重要な領域に局在しており,その酵素活性を低下あるいは消失させた.よって,POGLUT1の酵素活性の低下あるいは消失がこれらの疾患の原因となることが示唆され,この研究により明らかにされたRumiの詳細な酵素反応機構はNotchシグナルの活性化を制御する治療薬の開発に役立つ可能性がある.

はじめに

 Notchシグナル伝達系は細胞の運命決定において非常に重要な役割をはたし,進化的によく保存されている1).その異常により,種々のがんや遺伝病など多くの病態がひき起こされる2).Notchの細胞外ドメインに存在する36個のEGFリピートはO-結合型糖鎖による翻訳後修飾をうける3).近年の研究により,これらの糖鎖修飾がNotchの活性の制御において非常に重要であることがわかってきた.RumiはショウジョウバエにおいてNotchシグナル伝達系に必須のタンパク質として同定された,Notchの細胞外ドメインに存在するEGFリピートにグルコースを付加する糖転移酵素である.Rumiによるグルコースの付加はNotchの活性化に必須であるのに対し4),このグルコースへのキシロースの付加はNotchの活性化に対し抑制性にはたらくことがショウジョウバエにおいて示されている5)
 Rumiは供与基質であるUDP-グルコースから受容基質であるEGFリピートにグルコースを付加する糖転移酵素であり,1次配列にもとづく糖転移酵素のデータベースCAZyにおいてGT90ファミリーに分類される.GT90ファミリーに属する糖転移酵素は500以上も存在するが,これまでのところ,立体構造が明らかにされた例はない.また,タンパク質あるいはペプチドを受容基質とする糖転移酵素の構造が明らかにされた例はかぎられる.EGFリピートにフコースを付加する線虫の糖転移酵素POFUT1の構造が解かれているが,これはEGFリピートとの共結晶ではなくPOFUT1単独の構造である6).最近,筆者らは,EGFリピートにキシロースを付加するキシロース転移酵素XXYLT1と受容基質との共結晶の構造を明らかにしたが,XXYLT1とEGFリピートとの相互作用は非常にかぎられた領域にしか認められなかった7).このように,現在まで,糖転移酵素によりEGFリピートが直接に認識される機構は示されていなかった.

1.RumiとEGFリピートとの複合体の結晶構造

 ショウジョウバエのRumi遺伝子はヒトおよびマウスにおける相同遺伝子であるPOGLUT1遺伝子とおよそ50%の相同性をもつ8).N末端のシグナルペプチドを欠損させタグを付加した組換えRumiをHEK293T細胞に発現させ,培養上清に分泌されたタンパク質をアフィニティーカラムにより精製した.そして,大腸菌において発現させたヒトの凝固因子IXのEGFリピートとRumiとの複合体の共結晶化,および,そのX線結晶解析による構造解析に成功した(PDB ID:5F86).さらに,Rumi,EGFリピート,UDPからなる複合体(PDB ID:5F85),Rumi,グルコースの付加したEGFリピート,UDPからなる複合体(PDB ID:5F84),RumiとUDPとの複合体(PDB ID:5F87)の構造も解かれた.RumiとEGFリピートとの複合体において,RumiはA-ドメインおよびB-ドメインの2つのドメインからなり,それぞれ,糖転移酵素のGT-Bファミリーにみられる典型的なRossmannフォールドをもっていた.さらに,A-ドメインおよびB-ドメインは2本のジスルフィド結合により安定化されていた.EGFリピートはRumiのA-ドメインとB-ドメインのあいだに位置し,EGFの総表面積のおよそ1/3にあたる面でRumiと接していた.

2.RumiはEGFリピートの構造的な特徴を認識する

 Notchの細胞外ドメインに存在する36個のEGFリピートはすべて6つのCysをもち,これらが3本のジスルフィド結合を決まったパターンで形成しフォールディングを維持する.ところが,個々のEGFリピートのアミノ酸配列は異なっている.ショウジョウバエのNotchの細胞外ドメインにはグルコースの付加のコンセンサス配列をもつ18個のEGFリピートが存在するが,いずれもRumiによりグルコースが付加されている9).RumiはどのようにEGFリピートを認識するのだろうか? RumiとEGFリピートとの複合体の構造から,Rumiはきわめて効率よくEGFリピートの“かたち”を認識することが判明した(図1).EGFリピートのN末端の付近に位置するコンセンサス配列Cys51-Glu52-Ser53-Asn54-Pro55-Cys56はU字型のループ構造をとり,このループ構造がRumiのEGFリピートとの結合部位にすっぽりとはまるように存在していた.EGFリピートのCys51,Asn54,Cys56,Asn58の主鎖は,RumiのAla192,Pro197,Gln259,Gly260と相互作用し,また,EGFリピートのAsn54の側鎖は,RumiのAla192およびGln259と水素結合により相互作用していた.さらに,RumiのPhe122はEGFリピートのTyr69およびPro55と疎水性の相互作用をしていた.NotchのEGFリピートにおいてTyr69に相当する位置には芳香族アミノ酸残基であるTyrあるいはPheがよく保存されており,また,ショウジョウバエのNotchにおいてグルコースの付加のコンセンサス配列をもつ18個のEGFリピートすべてにおいてPro55が保存されていた.筆者らは,以前の解析により,EGFリピートのPro55はRumiの酵素活性に重要であることを示していた10).Tyr69をAlaに置換したEGFリピートの変異体を作製してRumiの酵素活性を調べたところ,野生型のEGFリピートと比較して変異体に対する酵素活性はいちじるしく低下した.また,RumiのPhe122およびGln259はEGFリピートとの結合部位のもっともせまい空間を規定し,ここに挿入されるのはループ構造のみであり,ほかの2次構造の挿入は不可能であると考えられた.RumiのPhe122およびGln259をそれぞれAlaと置換したところ,Rumiの酵素活性が野生型と比べ顕著に低下したことから,これらのアミノ酸残基の重要性が確かめられた.EGFリピートにおいてはPro55および2本のジスルフィド結合によりコンセンサス配列がU字型のループ構造をとるよう規定され,これにより,グルコースの付加されるSer53がRumiの活性中心に到達していた.

figure1

 RumiとEGFリピートとの複合体において,RumiとEGFリピートは高い構造的な相補性を示し,また,その相互作用表面はおもにループ構造からなっていたことから,複合体の形成にRumiあるいはEGFリピートの構造変化がともなうかどうか調べた.この問題を考察するため,Rumi-EGFリピート複合体とRumi-UDP複合体におけるRumiの構造を比較したところ,ほとんど変化はなかった.EGFリピートについては,構造変化はRumiとの相互作用に関与しない部位に限局していた.以上より,RumiおよびEGFリピートは複合体を形成する際に構造変化をともなわず,この複合体の形成はいわゆる鍵と鍵穴モデルの好例であると考えられた.

3.Rumiによる糖転移反応の触媒機構

 Rumiの供与基質であるUDP-グルコースはα結合をもつが,反応産物においてグルコースはSerとβ結合をしている.ゆえに,Rumiは結合反転型の糖転移酵素に分類される.酵素反応を原子レベルで調べるため,RumiとEGFリピートとの複合体の結晶にUDP-グルコースあるいはUDPを添加し,Rumi,グルコースの付加したEGFリピート,UDPからなる複合体,および,Rumi,EGFリピート,UDPからなる複合体の構造を解析した.Rumi,グルコースの付加したEGFリピート,UDPからなる複合体において,反応の副産物であるUDPはRumiのArg237およびArg298と相互作用し,さらに,RumiのSer231,Thr233,Ser296の側鎖により安定化されていた.
 Rumi,EGFリピート,UDPからなる複合体において,UDPとEGFリピートとのあいだに水分子2個およびグリセロール分子1個の電子密度が観察された.これらの分子の5つのヒドロキシル基の空間配置はボート型をとるグルコースのヒドロキシル基の空間配置と酷似していたので,UDP-グルコースのモデリングにより,Rumi,EGFリピート,UDP-グルコースからなるミカエリス複合体の構造を得た.このミカエリス複合体において,RumiのArg125は触媒塩基としてはたらくAsp151と相互作用し,EGFリピートのSer53にもっとも近づくようにしていた.この作用により,EGFリピートのSer53の側鎖のヒドロキシル基の酸素原子が供与基質であるUDP-グルコースのグルコースのC1炭素原子にむかうよう方向づけられる.この状態において,EGFリピートのSer53の側鎖のヒドロキシル基の酸素原子は,脱離するUDPとグルコースのC1炭素原子とのあいだのC-O結合に対しほぼ直線状に位置していた.これは,SN2置換反応により糖鎖の転移が起こることと矛盾しない.以上より,RumiのAsp151がEGFリピートのSer53の側鎖ヒドロキシル基を活性化する塩基としてはたらき,この活性化されたヒドロキシル基が求核基としてUDP-グルコースのグルコースのC1炭素原子と反応すること,また,RumiのArg237およびArg298は脱離するUDPのβリン酸基と相互作用し脱離を促進することが強く示唆された.さらに,Arg125,Asp151,Arg237,Arg298はRumiの酵素活性において非常に重要であることが変異体の解析により確かめられた.

4.Rumiの病態に関連する変異の酵素活性への影響

 Notchシグナルの異常が多くの種類のがんにおいて観察されている11).RumiはNotchシグナルの活性化に必須であるので,Rumi遺伝子にみられる変異はがんと関連するのではないかと考えた.データベースの検索により,Rumi遺伝子のヒトにおける相同遺伝子であるPOGLUT1遺伝子において26種類の変異が見い出された.これらの変異が,Rumi,EGFリピート,UDP-グルコースからなるミカエリス複合体モデルにおいてどこに位置しているか調べた.フレームシフトあるいはナンセンス変異については,いずれもRumiの酵素活性に必要な領域を欠損させるものであり,これらの変異はRumiを不活性化させることが強く示唆された.また,多くのミスセンス変異はRumiのA-ドメインに集積しており,B-ドメインにおいてミスセンス変異はほとんどみられなかった.ミスセンス変異がRumiの酵素活性に影響をおよぼすかどうか調べるため変異体を作製し,野生型と変異体の酵素活性を調べた.RumiのSer231は供与基質であるUDP-グルコースとの相互作用表面に位置し,ヒトのがんにおける変異であるLeuへの変異体より構造的な変化の小さいAlaへの変異体は,野生型に比べその酵素活性がいちじるしく低下した.RumiのGly189のArgへの変異およびGly199のValへの変異は基質との結合にかかわる領域に位置していた.以前の研究において,筆者らは,RumiのGly189のGluへの変異体は酵素活性をもたないことを示している4).RumiのGly199のValへの変異体を作製しその酵素活性を調べると,酵素活性はいちじるしく低下していた.RumiのArg245およびThr267はEGFリピートの結合にかかわる領域の安定化に寄与する.実際,がんで見い出されたArg245およびThr267の変異は酵素活性を顕著に低下させた.Rumiの酵素活性をいちじるしく低下あるいは消失させるような変異は,Notchが腫瘍抑制タンパク質として機能することが示唆されるがんにおいて見い出された.RumiはNotchシグナル伝達系に必須であるので,Notchシグナルの低下によりがんの発生が促進された可能性が高い.このことから,Rumiが腫瘍抑制タンパク質としての機能をもつ可能性が示された.
 Dowling-Degos病は皮膚における網状色素の沈着を主徴とする常染色体優性の非常にまれな疾患である.POGLUT1遺伝子においてDowling-Degos病の原因となる9種類の変異が同定されていたが,これらの変異がRumiの酵素活性に対しどう影響するかは調べられていなかった12).ホモロジーモデリングにより,Rumiの立体構造においてこれらの変異がどこに位置するかを決定した.その結果,フレームシフトあるいはナンセンス変異によりRumiの構造の維持に必要な領域が消失し,これらの変異によりRumiは酵素活性を失うことが示された.また,唯一,見い出されていたミスセンス変異は,さきに述べたRumiの酵素活性を担うArg298のTrpへの変異であったが,この変異体は酵素活性を示さなかった.以上より,Dowling-Degos病において見い出されたPOGLUT1遺伝子の変異はすべて酵素活性を消失させるものであることが示唆された.このことから,Rumiの機能の消失がDowling-Degos病の病因であることが支持された.

おわりに

 この研究において,Notchシグナルに必須の機能をはたす糖転移酵素Rumiの構造が基質との複合体として明らかにされた.さらに,構造生物学的および生化学的な研究により,Rumi遺伝子の変異によりもたらされる機能的な変化の分子基盤が明らかにされた.Dowling-Degos病において見い出された変異は酵素活性を消失させるものであり,さらに,がんに関連した変異についてもRumiの酵素活性を低下あるいは消失させるものであった.Rumiががん抑制タンパク質としてはたらく可能性が示されたが,これについてはさらなる解析が必要である.Dowling-Degos病において見い出された変異はがんの発生には寄与していなかった.参照したがんデータベースでは個々の患者においてその変異がホモ接合型なのかヘテロ接合型なのかは特定されていなかったが,仮にヘテロ接合型であるとするなら,Dowling-Degos病とは異なり,がんにおいてはRumiを含む複数の遺伝子に変異が起こり発がんにいたったのかもしれない.たとえば,多くのがんでみられるヘテロ接合性の消失,あるいは,Notchシグナル伝達に必要な別の遺伝子の異常などが可能性としてあげられる.
 原子レベルで明らかにされたRumiとその基質との複合体の立体構造は,今後,Notchシグナルに関連する疾患の治療薬の開発に役立つ可能性がある.Notchの活性化に必要なタンパク質の切断をつかさどるγセクレターゼの阻害薬は,すでにアルツハイマー病およびがんの治療を目的として開発が進んでいるが,特異性に起因した問題があるのも事実である.データベースによると,Rumiにより糖鎖修飾されるタンパク質は40以上ある.ゆえに,Rumiの阻害薬はNotchシグナルに関連したがんなどの疾患の治療に有効となる可能性があるが,Rumiの特異性および生体におけるその阻害の効果は注意深く調べられるべきであろう.

文 献

  1. Bray, S. J.: Notch signalling in context. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 17, 722-735 (2016)[PubMed]
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著者プロフィール

竹内 英之(Hideyuki Takeuchi)
略歴:2001年 東京大学大学院薬学系研究科 修了,2005年 同 助教,2006年 米国New York州立大学Stony Brook校 研究員,2008年 同Research Assistant Professorを経て,2015年より米国Georgia大学Associate Research Scientist.
研究テーマ:糖鎖の機能的な重要性に関する生化学的な研究.とくに,Notchシグナル伝達を制御するO-結合型糖鎖の機能.
関心事:子供の教育.アンチエイジング.地道な研究.

Robert S. Haltiwanger
米国Georgia大学 教授.

© 2016 竹内英之・Robert S. Haltiwanger Licensed under CC 表示 2.1 日本


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